Microbiologia

Obiettivi di apprendimento

  • Spiega come viene sintetizzato l’RNA usando il DNA come modello
  • Distingui la trascrizione nei procarioti e negli eucarioti

Durante il processo di trascrizione, l’informazione codificata nella sequenza di DNA di uno o più geni viene trascritta in un filamento di RNA, chiamato anche trascrizione di RNA. La molecola di RNA risultante, composta da ribonucleotidi contenenti le basi adenina (A), citosina (C), guanina (G) e uracile (U), agisce come una copia molecolare mobile della sequenza originale del DNA. La trascrizione nei procarioti e negli eucarioti richiede che la doppia elica del DNA si svolga parzialmente nella regione di sintesi dell’RNA. La regione srotolata è chiamata bolla di trascrizione. La trascrizione di un particolare gene procede sempre da uno dei due filamenti di DNA che funge da modello, il cosiddetto filamento antisenso. Il prodotto dell’RNA è complementare al filamento di DNA modello ed è quasi identico al filamento di DNA non modello, o filamento di senso. L’unica differenza è che nell’RNA, tutti i nucleotidi T sono sostituiti con nucleotidi U; durante la sintesi dell’RNA, la U è incorporata quando c’è una A nel filamento complementare antisenso.

Trascrizione nei batteri

I batteri usano la stessa RNA polimerasi per trascrivere tutti i loro geni. Come la DNA polimerasi, la RNA polimerasi aggiunge nucleotidi uno per uno al gruppo 3′-OH della catena nucleotidica in crescita. Una differenza critica nell’attività tra la DNA polimerasi e la RNA polimerasi è la necessità di un 3′-OH su cui aggiungere nucleotidi: La DNA polimerasi richiede un tale gruppo 3′-OH, rendendo così necessario un primer, mentre la RNA polimerasi non lo fa. Durante la trascrizione, un ribonucleotide complementare al filamento modello di DNA viene aggiunto al filamento di RNA in crescita e un legame covalente fosfodiestere si forma per sintesi di disidratazione tra il nuovo nucleotide e l’ultimo aggiunto. In E. coli, la RNA polimerasi comprende sei subunità polipeptidiche, cinque delle quali compongono il nucleo dell’enzima polimerasi responsabile dell’aggiunta di nucleotidi di RNA a un filamento in crescita. La sesta subunità è conosciuta come sigma (σ). Il fattore σ permette alla RNA polimerasi di legarsi a un promotore specifico, permettendo così la trascrizione di vari geni. Ci sono vari fattori σ che permettono la trascrizione di vari geni.

Inizio

L’inizio della trascrizione inizia da un promotore, una sequenza di DNA su cui il macchinario di trascrizione si lega e inizia la trascrizione. La coppia di nucleotidi nella doppia elica del DNA che corrisponde al sito da cui viene trascritto il primo nucleotide 5′ dell’RNA è il sito di iniziazione. I nucleotidi che precedono il sito di iniziazione sono designati “a monte”, mentre i nucleotidi che seguono il sito di iniziazione sono chiamati nucleotidi “a valle”. Nella maggior parte dei casi, i promotori si trovano appena a monte dei geni che regolano. Anche se le sequenze dei promotori variano tra i genomi batterici, alcuni elementi sono conservati. Nelle posizioni -10 e -35 all’interno del DNA prima del sito di iniziazione (designato +1), ci sono due sequenze di consenso del promotore, o regioni che sono simili in tutti i promotori e nelle varie specie batteriche. La sequenza di consenso -10, chiamata TATA box, è TATAAT. La sequenza -35 è riconosciuta e legata da σ.

Allungamento

L’allungamento in fase di trascrizione inizia quando la subunità σ si dissocia dalla polimerasi, permettendo all’enzima centrale di sintetizzare RNA complementare al modello di DNA in direzione 5′-3′ ad una velocità di circa 40 nucleotidi al secondo. Mentre l’elongazione procede, il DNA viene continuamente srotolato davanti all’enzima centrale e riavvolto dietro di esso (Figura 1).

Diagramma della trascrizione. Un pezzo di DNA a doppio filamento ha un grande ovale etichettato come RNA polimerasi seduto su di esso subito dopo una regione etichettata come promotore. Il DNA nella RNA polimerasi si è separato e il filamento di DNA inferiore (etichettato come filamento modello) ha un filamento di RNA di nuova formazione attaccato ad esso. Il filamento di RNA viene costruito da 5′ a 3′. L'altro filamento di DNA è il filamento non template e non ha RNA in costruzione.

Figura 1. Durante l’elongazione, l’RNA polimerasi batterica segue le tracce lungo il modello di DNA, sintetizza l’mRNA nella direzione da 5′ a 3′, e svolge e riavvolge il DNA mentre viene letto.

Terminazione

Una volta che un gene viene trascritto, la polimerasi batterica deve dissociarsi dal modello di DNA e liberare l’RNA appena prodotto. Questo viene chiamato terminazione della trascrizione. Il modello di DNA include sequenze nucleotidiche ripetute che agiscono come segnali di terminazione, causando lo stallo della RNA polimerasi e il suo distacco dal modello di DNA, liberando la trascrizione dell’RNA.

Pensaci

  • Dove si lega il fattore σ della RNA polimerasi al DNA per iniziare la trascrizione?
  • Cosa succede per iniziare l’attività di polimerizzazione dell’RNA polimerasi?
  • Da dove viene il segnale per terminare la trascrizione?

Trascrizione negli eucarioti

I procarioti e gli eucarioti eseguono fondamentalmente lo stesso processo di trascrizione, con alcune differenze significative (vedi Tabella 1). Gli eucarioti usano tre diverse polimerasi, RNA polimerasi I, II e III, tutte strutturalmente distinte dalla RNA polimerasi batterica. Ciascuna trascrive un diverso sottoinsieme di geni. È interessante notare che gli archei contengono una singola RNA polimerasi che è più strettamente legata alla RNA polimerasi II eucariotica che alla sua controparte batterica. Gli mRNA eucariotici sono anche di solito monocistronici, il che significa che ciascuno codifica un solo polipeptide, mentre gli mRNA procariotici di batteri e archei sono comunemente policistronici, il che significa che codificano polipeptidi multipli.

La differenza più importante tra procarioti ed eucarioti è il nucleo legato alla membrana di questi ultimi, che influenza la facilità di utilizzo delle molecole di RNA per la sintesi delle proteine. Con i geni legati in un nucleo, la cellula eucariota deve trasportare le molecole di RNA codificanti le proteine nel citoplasma per essere tradotte. I trascritti primari codificanti le proteine, le molecole di RNA sintetizzate direttamente dalla RNA polimerasi, devono subire diverse fasi di elaborazione per proteggere queste molecole di RNA dalla degradazione durante il tempo in cui vengono trasferite dal nucleo al citoplasma e tradotte in una proteina. Per esempio, gli mRNA eucariotici possono durare diverse ore, mentre il tipico mRNA procariotico non dura più di 5 secondi.

Il trascritto primario (chiamato anche pre-mRNA) viene prima rivestito di proteine stabilizzanti dell’RNA per proteggerlo dalla degradazione mentre viene elaborato ed esportato fuori dal nucleo. Il primo tipo di elaborazione inizia mentre il trascritto primario viene ancora sintetizzato; uno speciale nucleotide 7-metilguanosina, chiamato tappo 5′, viene aggiunto all’estremità 5′ del trascritto in crescita. Oltre a prevenire la degradazione, i fattori coinvolti nella successiva sintesi proteica riconoscono il tappo, che aiuta ad avviare la traduzione da parte dei ribosomi. Una volta che l’allungamento è completo, un altro enzima di elaborazione aggiunge una stringa di circa 200 nucleotidi di adenina all’estremità 3′, chiamata coda poly-A. Questa modifica protegge ulteriormente il pre-mRNA dalla degradazione e segnala ai fattori cellulari che il trascritto deve essere esportato nel citoplasma.

I geni eucarioti che codificano i polipeptidi sono composti da sequenze codificanti chiamate esoni (ex-on significa che sono espressi) e sequenze intermedie chiamate introni (int-ron denota il loro ruolo intermedio). Le sequenze di RNA trascritte corrispondenti agli introni non codificano regioni del polipeptide funzionale e vengono rimosse dal pre-mRNA durante l’elaborazione. È essenziale che tutte le sequenze di RNA codificate dagli introni siano completamente e precisamente rimosse da un pre-mRNA prima della sintesi proteica in modo che le sequenze di RNA codificate dagli esoni siano correttamente unite per codificare un polipeptide funzionale. Se il processo sbaglia anche di un solo nucleotide, le sequenze degli esoni ricongiunti sarebbero spostate e il polipeptide risultante non sarebbe funzionale. Il processo di rimozione delle sequenze di RNA codificate dagli introni e di riconnessione di quelle codificate dagli esoni è chiamato splicing dell’RNA ed è facilitato dall’azione di uno spliceosoma contenente piccole proteine ribonucleo nucleari (snRNP). Le sequenze di RNA codificate dagli introni vengono rimosse dal pre-mRNA mentre è ancora nel nucleo. Anche se non vengono tradotti, gli introni sembrano avere varie funzioni, tra cui la regolazione genica e il trasporto dell’mRNA. Al completamento di queste modifiche, il trascritto maturo, l’mRNA che codifica un polipeptide, viene trasportato fuori dal nucleo, destinato al citoplasma per la traduzione. Gli introni possono essere spliccati in modo diverso, con il risultato che vari esoni sono inclusi o esclusi dal prodotto finale dell’mRNA. Questo processo è noto come splicing alternativo. Il vantaggio dello splicing alternativo è che possono essere generati diversi tipi di trascritti di mRNA, tutti derivati dalla stessa sequenza di DNA. Negli ultimi anni, è stato dimostrato che anche alcuni archaea hanno la capacità di giuntare il loro pre-mRNA.

Tabella 1. Confronto della trascrizione nei batteri rispetto agli eucarioti
Proprietà Batteri Eucarioti
Numero di polipeptidi codificati per mRNA Monocistronico o policistronico Esclusivamente monocistronico
Elongazione del filamento core + σ = oloenzima RNA polimerasi I, II, o III
Addizione di 5′ cap No
Addizione di 3′ coda poly-A No
Splicing di pre-mRNA No

Visualizza come avviene lo splicing dell’mRNA guardando il processo in azione in questo video.

Guarda come vengono rimossi gli introni durante lo splicing dell’RNA qui.

Pensaci

  • Nelle cellule eucariotiche, come viene modificato il trascritto dell’RNA di un gene per una proteina dopo la sua trascrizione?
  • Gli esoni o gli introni contengono informazioni per le sequenze proteiche?

Clinical Focus: Travis, Parte 2

Questo esempio continua la storia di Travis iniziata in Le funzioni del materiale genetico.

Al pronto soccorso, un’infermiera disse a Travis che aveva preso una buona decisione di venire in ospedale perché i suoi sintomi indicavano un’infezione che era andata fuori controllo. I sintomi di Travis erano progrediti, con l’area di pelle colpita e la quantità di gonfiore in aumento. All’interno dell’area colpita, era iniziata un’eruzione cutanea, si erano formate vesciche e piccole sacche di gas sotto lo strato più esterno della pelle, e parte della pelle stava diventando grigia. Sulla base dell’odore putrido del pus che drenava da una delle vesciche, della rapida progressione dell’infezione e dell’aspetto visivo della pelle colpita, il medico iniziò immediatamente il trattamento per la fascite necrotizzante. Il medico di Travis ordinò una coltura del fluido che drenava dalla vescica e ordinò anche un esame del sangue, compresa la conta dei globuli bianchi.

Travis fu ricoverato in terapia intensiva e iniziò la somministrazione endovenosa di un antibiotico ad ampio spettro per cercare di ridurre al minimo l’ulteriore diffusione dell’infezione. Nonostante la terapia antibiotica, le condizioni di Travis si deteriorarono rapidamente. Travis divenne confuso e stordito. Entro poche ore dal suo ricovero in ospedale, la sua pressione sanguigna scese significativamente e la sua respirazione divenne più superficiale e più rapida. Inoltre, la formazione di vesciche è aumentata, con un’intensificazione del colore delle vesciche fino al nero violaceo, e la ferita stessa sembrava progredire rapidamente lungo la gamba di Travis.

  • Quali sono i possibili agenti causali della fascite necrotizzante di Travis?
  • Quali sono alcune possibili spiegazioni del perché il trattamento antibiotico non sembra funzionare?

Torneremo sull’esempio di Travis nelle pagine successive.

Concetti chiave e riassunto

  • Durante la trascrizione, le informazioni codificate nel DNA sono usate per fare RNA.
  • L’RNA polimerasi sintetizza l’RNA, usando il filamento antisenso del DNA come modello, aggiungendo nucleotidi di RNA complementari all’estremità 3′ del filamento crescente.
  • L’RNA polimerasi si lega al DNA in una sequenza chiamata promotore durante l’inizio della trascrizione.
  • I geni che codificano proteine con funzioni correlate sono frequentemente trascritti sotto il controllo di un singolo promotore nei procarioti, dando luogo alla formazione di una molecola di mRNA policistronica che codifica molteplici polipeptidi.
  • A differenza della DNA polimerasi, la RNA polimerasi non richiede un gruppo 3′-OH per aggiungere nucleotidi, quindi un primer non è necessario durante l’iniziazione.
  • La terminazione della trascrizione nei batteri avviene quando la RNA polimerasi incontra specifiche sequenze di DNA che portano allo stallo della polimerasi. Questo provoca il rilascio dell’RNA polimerasi dal filamento di DNA modello, liberando la trascrizione dell’RNA.
  • Gli eucarioti hanno tre diverse RNA polimerasi. Gli eucarioti hanno anche mRNA monocistronici, ognuno dei quali codifica solo un singolo polipeptide.
  • I trascritti primari eucarioti vengono elaborati in diversi modi, tra cui l’aggiunta di un cappuccio 5′ e di una coda 3′-poly-A, nonché lo splicing, per generare una molecola di mRNA matura che può essere trasportata fuori dal nucleo e che è protetta dalla degradazione.

Scelta multipla

Durante quale fase della trascrizione batterica è coinvolta la subunità σ della RNA polimerasi?

  1. iniziazione
  2. allungamento
  3. terminazione
  4. splicing
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Risposta a. La subunità σ della RNA polimerasi coinvolta nell’iniziazione.

Quale dei seguenti componenti è coinvolto nell’iniziazione della trascrizione?

  1. primer
  2. origine
  3. promoter
  4. codone di inizio
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Risposta c. Un promotore è coinvolto nell’inizio della trascrizione.

Quale delle seguenti non è una funzione del tappo 5′ e della coda 3′ poly-A di una molecola di mRNA eucariotica matura?

  1. facilitare lo splicing
  2. prevenire la degradazione dell’mRNA
  3. aiutare l’esportazione del trascritto maturo nel citoplasma
  4. aiutare il legame del ribosoma al trascritto
Mostra risposta

Risposta a. Facilitare lo splicing non è una funzione del tappo 5′ e della coda 3′ poly-A.

L’mRNA maturo di un eucariote conterrebbe ciascuna di queste caratteristiche tranne quale delle seguenti?

  1. RNA codificato da esoni
  2. RNA codificato da introni
  3. 5′ cap
  4. 3′ poly-A tail
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Risposta b. L’mRNA maturo di un eucariote non contiene RNA codificato da introni.

Fill in the Blank

Un mRNA ________ è uno che codifica per più polipeptidi.

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Un mRNA policistronico è uno che codifica per più polipeptidi.

Il complesso proteico responsabile della rimozione delle sequenze di RNA codificate da introni dai trascritti primari negli eucarioti è chiamato ________.

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Il complesso proteico responsabile della rimozione delle sequenze di RNA codificate da introni dai trascritti primari negli eucarioti è chiamato spliceosoma.

Pensaci

  1. Qual è lo scopo dell’elaborazione dell’RNA negli eucarioti? Perché i procarioti non richiedono un’elaborazione simile?
  2. Di seguito c’è una sequenza di DNA. Immagina che questa sia una sezione di una molecola di DNA che si è separata in preparazione per la trascrizione, quindi stai vedendo solo il filamento antisenso. Costruisci la sequenza di mRNA trascritta da questo modello.Filo di DNA antisenso: 3′-T A C T G A C T G A C G A T C-5′
  3. Preduci l’effetto di un’alterazione nella sequenza di nucleotidi nella regione -35 di un promotore batterico.

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