Pelle fossilizzata rivela coevoluzione con piume e metabolismo in dinosauri piumati e primi uccelli

Struttura del tessuto molle fossile

Piccole chiazze di tessuto (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d e Figg. supplementari 2-6) sono strettamente associate a piume fossili (cioè, di solito entro 500 µm di residui di piume carbonacee, Fig. 2e, g, j, k, o, s, t). Le macchie sono definitivamente di tessuto fossile, e non riflettono la contaminazione superficiale con materiale moderno durante la preparazione del campione, poiché sono conservate nel fosfato di calcio (vedi ‘Tafonomia’, sotto); inoltre, diversi campioni mostrano margini che sono sovrapposti, in parte, dalla matrice circostante. I tessuti non hanno, quindi, semplicemente aderito alla superficie del campione come risultato della contaminazione da particelle trasportate dall’aria in laboratorio.

Le chiazze di tessuto sono tipicamente 3-6 µm di spessore e planari (Fig. 1a-e). Le sezioni trasversali e le superfici fratturate mostrano uno strato fibroso interno (1,0-1,2 µm di spessore) tra due strati senza struttura più sottili (0,2-0,5 µm di spessore) (Fig. 1f-h). La superficie esterna dello strato senza struttura è liscia e può mostrare una sottile struttura poligonale definita da poligoni larghi 10-15 µm (Fig. 1e, h).

Lo strato fibroso mostra anche poligoni (Figg. 1f, h e 2a-e, e Fig. 6 supplementare) che contengono schiere di fibre densamente imballate larghe 0.1-0.5 µm (Fig. 2f-i e Fig. 5f supplementare). Le fibre ben conservate mostrano torsioni elicoidali (Fig. 2h, i). Le fibre nelle parti marginali di ogni poligono sono larghe 0,1-0,3 µm e orientate parallelamente alla superficie del tessuto; quelle all’interno di ogni poligono sono larghe 0,3-0,5 µm e sono solitamente perpendicolari alla superficie del tessuto (Fig. 2b, h e Fig. supplementare S6d). Nei 1-2 µm marginali di ogni poligono, le fibre sono di solito ortogonali al margine laterale del poligono e terminano o fanno da ponte alla giunzione tra poligoni adiacenti (Fig. 2f, g e Fig. supplementare 6e). I poligoni sono di solito equidimensionali ma sono localmente allungati e reciprocamente allineati, dove le fibre spesse in ogni poligono sono sub-parallele alla superficie del tessuto e le fibre sottili, parallele al margine del poligono (Fig. 2j, k e Fig. supplementare 6g-l). Alcuni poligoni mostrano una depressione centrale (Fig. 2c-e e Fig. 6a-c supplementari) in cui le fibre spesse possono avvolgere una struttura globulare larga 1-2 µm (Fig. 2e).

Corneociti fossili

La struttura di questi tessuti fossili differisce da quella delle conchiglie dei conchostraci e delle squame dei pesci del sedimento ospite, della conchiglia del moderno Mytilus, della rachide delle piume moderne e fossili e dell’epidermide dei rettili moderni (Fig. 7a-n supplementare). La geometria allungata di alcuni poligoni (Fig. 2j, k e Fig. 6g, l) implica una deformazione elastica di un tessuto non biomineralizzato dovuta a stress meccanico. Sulla base delle loro dimensioni, geometria e struttura interna, le strutture poligonali sono interpretate come corneociti (cheratinociti epidermici). Negli amnioti moderni, queste sono cellule poliedriche-appiattite (1-3 µm × ca. 15 µm) riempite di tonofibrille di cheratina, lipidi e proteine di matrice18,19,20 (Fig. 3a, b e Figure supplementari 2u-x, 8, 9). Lo strato esterno senza struttura del materiale fossile corrisponde al margine cellulare; è più spesso del modello biologico originale, cioè l’involucro cellulare corneo e/o la membrana cellulare, ma questo non è inaspettato, riflettendo la sovracrescita diagenetica da fosfato di calcio (vedi ‘Tafonomia’). Le fibre nei corneociti fossili sono identificate come tonofibrille mineralizzate: fasci dritti e non ramificati di fibrille di α-cheratina superavvolte larghe 0,25-1 µm18,21 che sono la componente principale del citoscheletro corneocitario22 e sono avvolte da proteine citoscheletriche amorfe22. Nei fossili, le sottili tonofibrille spesso si sovrappongono a quelle della cellula adiacente (Fig. 2g e Fig. 6e supplementare), ma localmente possono colmare il confine tra cellule adiacenti (Fig. 2f). Quest’ultimo ricorda i desmosomi, regioni di forte attaccamento intercellulare tra i corneociti moderni23. Le strutture globulari centrali all’interno dei corneociti fossili assomigliano a nuclei di cellule morte24 , come nei corneociti degli uccelli attuali (ma non nei rettili e nei mammiferi attuali)24 (Fig. 8 supplementare). La posizione di questi nuclei picnotici è spesso indicata da depressioni nella superficie corneocitaria negli uccelli estinti24 (Fig. 3b); alcune cellule fossili mostrano depressioni simili (Fig. 2c e Fig. 6a-c supplementare).

Tafonomia

La cheratina è una biomolecola relativamente recalcitrante a causa della sua struttura paracristallina fortemente reticolata e del carattere idrofobico non polare23. La replicazione dei corneociti fossili nel fosfato di calcio è quindi in qualche modo inaspettata, dato che questo processo di solito richiede ripidi gradienti geochimici caratteristici del decadimento precoce25 e di solito si applica a tessuti soggetti a decadimento, come i muscoli26 e i tessuti digestivi27. I tessuti recalcitranti come il collagene dermico possono, tuttavia, essere replicati in fosfato di calcio dove contengono una fonte intrinseca di calcio e, in particolare, di ioni fosfato che vengono liberati durante il decadimento28. I corneociti contengono fonti di entrambi questi ioni. Durante la differenziazione terminale, le concentrazioni intracellulari di calcio aumentano29 e le catene di α-cheratina sono ampiamente fosforilate23. Inoltre, i granuli lipidici dei corneociti30 sono ricchi di fosforo e fosfato31. Queste sostanze chimiche verrebbero rilasciate durante la degradazione dei granuli e precipiterebbero sul substrato organico rimanente, cioè le tonofibrille.

Nei mammiferi estinti, le matrici densamente imballate di tonofibrille richiedono abbondanti proteine della matrice intercheratina per la stabilità32 . Queste proteine, tuttavia, non sono evidenti nei fossili. Questo non è inaspettato, poiché le proteine sono rare nei corneociti aviari esistenti33 e, criticamente, si presentano come monomeri dispersi34 e avrebbero un potenziale di conservazione inferiore rispetto ai fasci di cheratina altamente reticolati e polimerizzati delle tonofibrille. Lo strato esterno senza struttura dei corneociti fossili è più spesso del probabile modello biologico, cioè l’involucro cellulare corneo (uno strato di lipidi, cheratina e altre proteine spesso fino a 100 nm che sostituisce la membrana cellulare durante la differenziazione terminale34) e/o la membrana cellulare. Ciò può riflettere un microambiente locale favorevole alla precipitazione del fosfato di calcio: durante la differenziazione terminale, i granuli di cheratoialina, una proteina ampiamente fosforilata35 con un’alta affinità per gli ioni di calcio36, si accumulano alla periferia dei corneociti in via di sviluppo37. Lo spessore dello strato solido esterno di fosfato di calcio nei fossili, più la transizione graduale da questo allo strato fibroso interno, suggerisce che la precipitazione del fosfato proceda dai margini verso l’interno dei corneociti. In questo scenario, la disponibilità di fosfato nelle zone marginali delle cellule avrebbe superato quella richiesta per replicare le tonofibrille. Il fosfato aggiuntivo sarebbe precipitato come fosfato di calcio negli spazi interstiziali tra le tonofibrille, procedendo verso l’interno dalla faccia interna del margine della cellula.

Skin shedding in feathered dinosaurs and early birds

In amnioti estanti, lo strato epidermico cornificato è tipicamente spesso 5-20 cellule (ma lo spessore varia tra le specie e la posizione sul corpo38). Le macchie di corneociti fossili, tuttavia, sono una cella di spessore (Fig. 1f e Figg. supplementari 5c, 10). Questo, più la dimensione piccola coerente (<400 μm) delle patch e la fedeltà notevolmente alta di conservazione, non è coerente con la conservazione selettiva di un foglio continuo di tessuto in situ. In una minoranza (n = 8) di esempi, la pelle si trova sul bordo del campione di tessuti molli fossili e quindi potrebbe potenzialmente rappresentare un frammento più piccolo di un pezzo di pelle fossile originariamente più grande (con il resto del pezzo sulla lastra fossile). Nella maggior parte degli esempi, tuttavia, l’intero contorno del frammento di pelle è contenuto all’interno del margine di un campione. L’esame dei margini di vari campioni ad alto ingrandimento rivela che il campione e il sedimento circostante sono spesso esattamente sullo stesso piano (ad esempio, Fig. 10 supplementare). Anche quando il margine del campione di pelle è coperto dal sedimento, è improbabile che il campione sia stato molto più grande delle dimensioni apparenti, poiché la pelle fossile, essendo quasi perfettamente planare, forma un piano naturale di spaccatura.

Non ci sono prove che lo spessore conservato della pelle sia un artefatto di preparazione o erosione. Durante la spaccatura di una lastra di roccia, il piano di spaccatura passa frequentemente attraverso i tessuti molli in modo non uniforme, esponendo strutture a diverse profondità. Nei fossili qui studiati, il piano di spaccatura di solito passa attraverso i corneociti (esponendo la loro struttura interna), e raramente lungo la faccia esterna dello strato corneocitario. Non ci sono prove di rimozione di più di uno strato di corneociti: Le sezioni FIB mostrano la conservazione di un solo strato e diverse immagini SEM mostrano sezioni verticali complete attraverso la pelle conservata (dove il rapporto con il sedimento sovrastante e sottostante è visibile), con evidenza di un solo strato di corneociti. Il riempimento interno fibroso dei corneociti fossili è esposto dove il piano di spaccatura della lastra fossile passa attraverso le chiazze di tessuto. La topografia dei corneociti fossili, tuttavia, varia con la posizione del piano di spaccatura, che può variare localmente attraverso i tessuti molli su scala millimetrica: i corneociti possono presentarsi con margini rialzati e una depressione centrale, o con margini depressi e una zona centrale rialzata (Fig. S9).

Le dimensioni, la geometria irregolare e lo spessore delle chiazze di corneociti assomigliano ai fiocchi sparsi dello strato cornificato (particelle simili a forfora39; Fig. 3). Negli uccelli esistenti, i corneociti sono sparsi individualmente o in chiazze fino a 0,5 mm2 che possono essere trascinati all’interno delle piume (Fig. 3c, d e Fig. 2u, v). I fossili qui descritti forniscono la prima prova del processo di mutamento della pelle negli uccelli basali e nei dinosauri non aviari maniraptoran e confermano che almeno alcuni dinosauri non aviari si liberano della loro pelle in piccole chiazze40. Questo stile di muta è identico a quello degli uccelli moderni18 (Fig. 3c, d) e dei mammiferi20 e implica una crescita somatica continua. Questo contrasta con molti rettili esistenti, ad es, lepidosauri, che spargono la loro pelle intera o in grandi sezioni21, ma lo stile di spargimento può essere influenzato da fattori come la dieta e l’ambiente41.

Implicazioni evolutive della struttura dei corneociti fossili

I corneociti fossili mostrano adattamenti chiave trovati nelle loro controparti negli uccelli e mammiferi attuali, in particolare la loro geometria poligonale appiattita e contenuti cellulari fibrosi coerenti con tonofibrille α-cheratina16. Inoltre, le tonofibrille fossili (come negli esempi esistenti22) mostrano robuste connessioni intercellulari e formano un’impalcatura continua attraverso il foglio corneocyte (Fig. 2b, c, j e Fig. 6 supplementare). Al contrario, i corneociti nei rettili estanti contengono una massa omogenea di β-cheratina (con proteine aggiuntive presenti nell’involucro cellulare) e si fondono durante lo sviluppo, formando strati β maturi senza confini cellulari distinti42. La conservazione dei nuclei picnotici nei corneociti fossili è una caratteristica distintamente aviaria non vista nei rettili moderni (ma vedi rif. 20).

La morfogenesi e la differenziazione epidermica sono considerate divergenti nei terapsidi e nei sauropsidi31. I nostri dati supportano altre prove che le caratteristiche epidermiche condivise negli uccelli e nei mammiferi indicano un’evoluzione convergente43 e suggeriscono che i contenuti corneocitari ricchi di lipidi possono essere caratteri evolutivamente derivati negli uccelli e nei maniraptorani non aviari piumati. Studi di evo-devo hanno suggerito che l’epidermide aviaria potrebbe essere sorta dall’espansione delle regioni di cerniera nella pelle squamosa “protopiuma “20. Sebbene manchino prove fossili di questa transizione, i nostri dati mostrano che l’epidermide degli uccelli basali e dei dinosauri non aviari maniraptorani aveva già evoluto un carattere decisamente moderno, anche nei taxa non in grado di volare. Ciò non esclude la possibilità che almeno alcune delle caratteristiche epidermiche qui descritte abbiano avuto origine in teropodi più basali, specialmente laddove la pelle conservata manca dell’evidenza delle squame (come in Sciurumimus44). Meccanismi genomici raffinati per modulare l’espressione complessa della cheratina nell’epidermide45 , la differenziazione terminale dei cheratinociti e la suddivisione della sintesi di α- e β-cheratina nella pelle degli animali piumati32 sono stati probabilmente modificati in tandem con l’evoluzione delle piume vicino alla base dei Maniraptora entro la fine del Giurassico medio (Fig. 4). I dati fossili esistenti suggeriscono che questo avvenne dopo l’evoluzione del becco nei Maniraptoriformi e prima dell’evoluzione della patagia degli arti anteriori e delle pterilie (Fig. 4); le prime occorrenze fossili di tutte queste caratteristiche coprono circa 10-15 Ma, suggerendo un’esplosione di innovazione nell’evoluzione del tegumento piumato vicino e attraverso il confine del Giurassico inferiore-medio. La prova più antica della muscolatura dermica associata alle piume è di circa 30 Ma più giovane, in un uccello ornitotoraceo di 125 Ma17. Dato il ruolo essenziale svolto da questa rete dermica nel supporto delle piume e nel controllo dell’orientamento delle piume18 , la sua assenza nei maniraptorani non aviari con piume può riflettere un pregiudizio tafonomico.

In certi aspetti, i corneociti fossili sono distintamente non aviari e indicano che i dinosauri piumati e i primi uccelli avevano un’anatomia tegumentale unica e una fisiologia di transizione tra quella degli uccelli moderni e dei dinosauri senza piume. Negli uccelli attuali, le tonofibrille dei corneociti sono disperse liberamente tra i lipidi intracellulari19; questo facilita il raffreddamento evaporativo in risposta alla produzione di calore durante il volo e l’isolamento dal piumaggio46. Al contrario, le tonofibrille fossili sono densamente imballate e riempiono l’interno della cellula. Non ci sono prove di restringimento post-mortem dei corneociti fossili: la gamma di dimensioni è coerente con quelle degli uccelli moderni, e non ci sono prove di rugosità diagenetica, contorsione o separazione delle singole cellule. Questo suggerisce fortemente che la densità conservata di tonofilamenti nei corneociti fossili riflette densità originariamente più elevate rispetto agli uccelli attuali. Questo non è una funzione delle dimensioni del corpo: gli uccelli esistenti di dimensioni diverse (ad esempio, il fringuello zebrato e lo struzzo) mostrano tonofibrille vagamente disperse47. È quindi probabile che gli uccelli fossili avessero una minore esigenza fisiologica di raffreddamento evaporativo e, a sua volta, una minore produzione di calore corporeo legata all’attività di volo46 rispetto agli uccelli moderni. Questo è coerente con altre prove di bassi tassi metabolici basali nei dinosauri non aviari maniraptorani47,48 e negli uccelli basali47 e con le ipotesi che le piume di Microraptor49 e, potenzialmente, Confuciusornis48 (ma vedi rif. 50) non erano adattate per il volo a motore, almeno per periodi prolungati50.