Proteine

Il lisozima fu il primo enzima di cui fu determinata la struttura a raggi X ad alta risoluzione. Questo fu ottenuto nel 1965 da David Phillips, lavorando alla Royal Institution di Londra. Phillips propose un meccanismo per l’azione del lisozima basato principalmente sui dati strutturali. Il meccanismo di Phillips è stato poi confermato dall’evidenza sperimentale, come vedremo più avanti.

Il lisozima si trova ampiamente nelle cellule e nelle secrezioni (incluse lacrime e saliva) dei vertebrati, e l’albume delle uova di gallina è particolarmente ricco di questo enzima. Il lisozima catalizza l’idrolisi dei legami glicosidici che collegano l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) nei polisaccaridi delle pareti cellulari batteriche. Così facendo, danneggia l’integrità della parete cellulare e quindi agisce come agente batteriocida. Il legame NAM-NAG è rappresentato nella Figura 40, con indicato il sito di scissione da parte del lisozima.

Figura 40 Parte del componente polisaccaridico delle pareti cellulari batteriche, che mostra l’alternanza di residui di acido N-acetilmuramico (NAM) e N-acetilglucosamina (NAG). Questo polisaccaride è un substrato per il lisozima, che idrolizza il legame glicosidico nella posizione indicata. (Per chiarezza, e per permettere una rappresentazione lineare della molecola, alcuni dei legami sono mostrati a zig-zag.)

Il lisozima è un enzima relativamente piccolo. Il lisozima dell’albume di gallina consiste in un singolo polipeptide di 129 aminoacidi di lunghezza (Figura 41) con Mr 14 600. Dai dati di diffrazione dei raggi X, possiamo vedere che c’è una spaccatura distinta nella struttura del lisozima (Figura 42). Il sito attivo si trova in questa fessura. Nella sequenza aminoacidica in Figura 41 e nel modello di riempimento dello spazio del lisozima in Figura 42, sono stati evidenziati quei residui che rivestono la tasca di legame del substrato nella proteina ripiegata.

Figura 41 La sequenza aminoacidica del lisozima dell’albume di gallina, con i residui che rivestono la tasca di legame del substrato evidenziati in grigio. Asp 52 e Glu 35, residui chiave nel sito attivo, sono evidenziati rispettivamente in rosso e giallo.

Figura 42 Un modello a riempimento di spazio del lisozima di albume di gallina in cui sono stati evidenziati i residui chiave. Asp 52 è in rosso; Glu 35 è in giallo; alcuni dei residui che rivestono la tasca di legame del substrato sono mostrati in grigio.

Il sito attivo del lisozima è un lungo solco che può ospitare sei zuccheri della catena polisaccaridica alla volta. Legando il polisaccaride, l’enzima idrolizza uno dei legami glicosidici. Se i sei zuccheri nel tratto di polisaccaride sono identificati come A-F, il sito di scissione è tra D ed E, come indicato nella Figura 40. I due frammenti di polisaccaride vengono quindi rilasciati. La Figura 43 rappresenta le fasi di questa reazione, che sono anche descritte in dettaglio di seguito.

Figura 43 Il meccanismo catalitico del lisozima. Si noti che sono mostrati solo i residui chiave coinvolti nella catalisi (Glu 35 e Asp 52). Le fasi sono descritte in dettaglio nel testo. (Basato su Phillips, 1966)

1. Al legame con l’enzima, il substrato adotta una conformazione tesa. Il residuo D è distorto (non mostrato nel diagramma) per ospitare un gruppo -CH2OH che altrimenti avrebbe un contatto sfavorevole con l’enzima. In questo modo, l’enzima costringe il substrato ad adottare una conformazione che si avvicina a quella dello stato di transizione.

2. Il residuo 35 dell’enzima è acido glutammico (Glu 35) con un protone che trasferisce facilmente all’atomo O polare del legame glicosidico. In questo modo, il legame C-O nel substrato viene scisso (Figura 43a e b).

3. Il residuo D del polisaccaride ha ora una carica positiva netta; questo intermedio di reazione è noto come ione ossonio (Figura 43b). L’enzima stabilizza questo intermedio in due modi. In primo luogo, un vicino residuo di aspartato (Asp 52), che è in forma di carbossilato caricato negativamente, interagisce con la carica positiva dello ione ossonio. In secondo luogo, la distorsione del residuo D permette di condividere la carica positiva tra il suo atomo C e O. (Si noti che questa condivisione di carica tra gli atomi è chiamata risonanza allo stesso modo della condivisione di elettroni tra gli atomi del gruppo peptidico). Così lo ione ossonio intermedio è lo stato di transizione. Normalmente, un tale intermedio sarebbe molto instabile e reattivo. Asp 52 aiuta a stabilizzare lo ione ossonio, ma non reagisce con esso. Questo perché, a 3 Å di distanza, i gruppi reattivi sono troppo distanti.

4. L’enzima ora rilascia il residuo E con il suo polisaccaride attaccato, producendo un glicosil-enzima intermedio. Lo ione ossonio reagisce con una molecola d’acqua dall’ambiente solvente, estraendo un gruppo idrossile e riprotonando Glu 35 (Figura 43c e d).

5. L’enzima rilascia quindi il residuo D con il suo polisaccaride attaccato e la reazione è completa.

Il meccanismo Phillips per la catalisi del lisozima, come descritto sopra, è supportato da una serie di osservazioni sperimentali. In particolare, l’importanza di Glu 35 e Asp 52 nel processo è stata confermata da esperimenti di site-directed mutagenesis (SDM). La SDM è una tecnica molto potente per esaminare il ruolo di singoli residui aminoacidici nella funzione di una proteina e sarà discussa in dettaglio nella sezione 7.2. La SDM comporta l’uso della tecnologia del DNA ricombinante per sostituire selettivamente il residuo di interesse con un diverso aminoacido con proprietà criticamente diverse. La proteina risultante può quindi essere testata dal punto di vista funzionale, ad esempio per quanto riguarda il legame del substrato o l’attività catalitica. Quando questa tecnica è stata applicata al lisozima per sostituire Glu 35 con un residuo di glutammina (Gln), la proteina risultante poteva ancora legare il substrato (anche se meno fortemente) ma non aveva attività catalitica. Glu 35 è quindi essenziale per l’attività catalitica del lisozima. Quando Asp 52 è stato sostituito con un residuo di asparagina (Asn), la proteina mutante aveva meno del 5% dell’attività catalitica del lisozima normale (wild-type), nonostante il fatto che la forma mutante avesse un’affinità due volte maggiore per il substrato. Ne consegue che l’Asp 52 è essenziale per l’attività catalitica del lisozima. Esperimenti che hanno utilizzato agenti chimici che hanno modificato covalentemente questi residui, senza influenzare significativamente la struttura a raggi X, hanno analogamente dimostrato che essi sono essenziali per l’attività catalitica.