Relazioni tra la dimensione del serbatoio del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) nelle cellule T del sangue periferico CD4+ e i rapporti tra cellule T CD4+:CD8+ T Cell Ratios in individui infetti da HIV-1 Aviremic che ricevono una terapia antiretrovirale altamente attiva a lungo termine

Abstract

È stato dimostrato che la replicazione del virus dell’immunodeficienza umana tipo 1 (HIV-1) persiste nella maggior parte degli individui infetti che ricevono una terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART). Tuttavia, gli studi che affrontano la relazione tra i bassi livelli di replicazione virale in corso e i parametri immunologici, come il rapporto cellule T CD4+:CD8+, in tali individui sono stati carenti. Qui, viene mostrata una correlazione inversa statisticamente significativa tra la frequenza delle cellule T CD4+ che trasportano il DNA provirale dell’HIV-1 e il rapporto cellule T CD4+:CD8+ in individui infetti che ricevono la HAART e nei quali la viremia plasmatica era stata soppressa al di sotto del limite di rilevazione per periodi di tempo prolungati. Nessuna correlazione è stata trovata tra la frequenza dei linfociti T citotossici CD8+ HIV-1-specifici (CTL) e il rapporto cellule T CD4+:CD8+ in questi individui. Questi dati suggeriscono che la replicazione virale persistente, a basso livello, in corso, anche se non sufficiente a mantenere le risposte CTL HIV-1 specifiche, può spiegare, in parte, perché la normalizzazione del rapporto cellule T CD4+ :CD8+ non viene raggiunta in alcuni individui infetti trattati con successo con la HAART.

L’uso della terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART) nel trattamento degli individui infettati dal virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV- 1) ha cambiato radicalmente l’esito clinico per molte persone infette e ha portato a un sostanziale calo dell’incidenza dell’AIDS e della mortalità. Tuttavia, la presenza di virus compatibile con la replicazione, di DNA provirale dell’HIV-1 (compresi 2 cerchi di ripetizione terminale lunga), di RNA dell’HIV-1 spliced e unspliced nelle cellule T CD4+ e di reservoir virali non identificati è stata dimostrata nella maggior parte degli individui infetti in cui la viremia plasmatica è scesa sotto il limite di rilevazione, e queste fonti di replicazione in corso sono emerse come il principale ostacolo nell’impedire l’eradicazione dell’HIV-1.

Dopo l’inizio della HAART, la viremia plasmatica diminuisce rapidamente al di sotto del limite di rilevazione in un’alta percentuale di individui infetti ed è seguita da un graduale aumento della conta delle cellule T CD4+ e una diminuzione di quelle CD8+. Tuttavia, la normalizzazione del rapporto cellule T CD4+:CD8+ non viene raggiunta in alcuni individui infetti che hanno altrimenti risposto con successo alla HAART. A questo proposito, è stato suggerito che i livelli cronicamente elevati di cellule T CD8+ o i rapporti anormali di cellule T CD4+:CD8+ nel sangue periferico sono guidati dalla replicazione virale attiva in individui infetti che non sono trattati o che ricevono una terapia antivirale non ottimale. Inoltre, l’espressione del marcatore di attivazione CD38 sulle cellule T CD8+ ha dimostrato di essere un marcatore prognostico della progressione della malattia. Anche se è stato suggerito che la mancata normalizzazione del rapporto cellule T CD4+:CD8+ in alcuni pazienti che ricevono la HAART è attribuita alla soppressione incompleta della replicazione virale, non ci sono dati riportati che affrontino direttamente questa domanda, soprattutto nei pazienti che hanno ricevuto la HAART per periodi di tempo prolungati e nei quali la viremia plasmatica è stata ben soppressa.

È stato stabilito che il serbatoio di cellule T CD4+ infette nel sangue periferico, determinato dal numero di cellule portatrici del DNA provirale dell’HIV-1, è mantenuto dalla replicazione virale in corso, anche a livelli molto bassi. Nel presente studio, abbiamo valutato la relazione tra il rapporto tra la conta delle cellule T CD4+:CD8+ e la frequenza delle cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1 nelle cellule T CD4+ purificate, nonché la frequenza dei linfociti T CD8+ citotossici (CTL) HIV-specifici in individui infetti che avevano ricevuto la HAART per periodi di tempo prolungati e nei quali la viremia plasmatica è stata soppressa al di sotto del livello di rilevazione, come determinato dai test standard.

Pazienti e metodi

Isolamento delle cellule T CD4+. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state ottenute mediante centrifugazione a gradiente di densità ficoll-hypaque. Le cellule T CD4+ sono state isolate dai PBMC di individui infetti da HIV-1, utilizzando una tecnica di separazione cellulare su colonna (Stem-Cell Technologies), come descritto altrove. Per determinare la frequenza delle cellule T CD4+ portatrici del provirus HIV-1 negli individui infetti, è stata eseguita una PCR in tempo reale come descritto di seguito. Il DNA genomico è stato isolato da 1-2 × 106 cellule T CD4+ purificate, utilizzando il kit di isolamento del DNA Puregene (Gentra), secondo le specifiche del produttore. Il DNA (1 µg) è stato quindi utilizzato come modello per la PCR in tempo reale in un iCycler (Bio-Rad). La reazione di amplificazione è stata eseguita in triplicato usando 0,5 µM di primer, 0,2 µM di sonda fluorescente, 0,8 µM di dNTP, 5 µM di MgCl2 e 2,5 U di Taq Polimerasi Platinum (Life Technologies) in un volume totale di 50 mL. I primer 5′- GGTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (primer 5′) e 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (primer 3′) sono stati utilizzati insieme alla sonda fluorescente 5′-6FAM-AGTAGTGTGTCCCGTCTGTTTAMRA- 3′. Le condizioni della PCR consistevano in una fase di denaturazione a 95°C per 3 minuti, seguita da 45 cicli di 15 s a 95°C e 1 minuto a 58°C. Anche il DNA ACH-2 diluito seriamente è stato sottoposto alla PCR di cui sopra per ottenere le curve standard.

Analisi citometrica a flusso delle cellule T CD8+ HIV-1-specifiche. La frequenza delle cellule T CD8+ specifiche per HIV-1 è stata determinata dall’analisi delle cellule intracellulari positive all’interferone (IFN)-γ dopo la stimolazione con peptidi specifici per HIV-1 (20 mer sovrapposti a 15 aa). I pool di peptidi sovrapposti (1 µg ciascuno; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) che coprono l’intera sequenza HIV-1 gag, pol, env e nef sono stati inizialmente incubati con 3 × 106 PBMC per 10 minuti in una provetta a fondo tondo da 5 mL (Becton Dickinson) in 0,1 mL di terreno completo in un incubatore a 37°C CO2. Successivamente, 0,4 mL di terreno completo è stato aggiunto alla provetta, e, dopo un’incubazione di 2 ore, Brefeldin A (Sigma) è stato aggiunto al mezzo ad una concentrazione finale di 10 mg/mL per inibire la secrezione di IFN-γ. Dopo 6 ore di incubazione, le cellule sono state lavate due volte, fissate con 1 × soluzione di fissaggio (Becton Dickinson) per 10 minuti a temperatura ambiente, e lavate di nuovo. Le cellule sono state permeabilizzate con 1 × soluzione di permeabilizzazione 2 (Becton Dickinson), e sono stati ulteriormente incubati a temperatura ambiente per 10 min. Dopo essere stato lavato di nuovo, le cellule sono state colorate con i seguenti anticorpi: fluoresceina isotiocianato coniugato anti-CD8, ficoeritrina coniugato anti-IFN-γ, peridina- proteina clorofilla coniugato anti-CD69, e alloficocianina coniugato anti-CD3 (Becton Dickinson). Con un gate sui linfociti CD3+CD8+, ~100.000 eventi sono stati raccolti, utilizzando un FACSCalibur (Becton Dickinson), e la frequenza di IFN-γ + cellule CD69+ è stata determinata utilizzando il software Cellquest (Becton Dickinson).

Analisi statistica. La correlazione di rango di Spearman è stata usata come misura della correlazione tra (1) la frequenza delle cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1 e la conta delle cellule T CD4+ e CD8+ e il rapporto cellule T CD4+:CD8+ e (2) la frequenza dei CTL HIV-1- specifici e la conta delle cellule T CD4+ e CD8+, il rapporto cellule T CD4+:CD8+ e il numero delle cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per determinare l’associazione dei rapporti cellule T CD4+:CD8+ ⩾1.0 o <1.0 con i carichi provirali nel comparto delle cellule T CD4+. Il metodo Bonferroni per l’aggiustamento dei valori P per i test multipli è stato applicato alle correlazioni dei conteggi delle cellule T CD4+ e CD8+ e del rapporto cellule T CD4+:CD8+ con la frequenza delle cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1, ed è stato applicato alle correlazioni dei conteggi delle cellule T CD4+ e CD8+, del rapporto cellule T CD4+:CD8+ e dei livelli di DNA provirale dell’HIV-1 nel comparto delle cellule T CD4+ con la frequenza dei CTL HIV-1 specifici.

Risultati

Correlazione tra la dimensione della riserva di cellule T CD4+ di HIV-1 e i parametri immunologici. Per studiare la relazione tra la dimensione della riserva di cellule T CD4+ del sangue periferico per l’HIV-1 e i parametri immunologici periferici anormali in individui infetti che ricevono con successo la HAART per periodi di tempo prolungati, abbiamo cercato di stabilire correlazioni tra la frequenza di cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1 e il numero di cellule T CD4+ e CD8+ e il rapporto cellule T CD4+ :CD8+. C’era una correlazione inversa statisticamente significativa tra la frequenza delle cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1 e la conta delle cellule T CD4+ nel sangue periferico degli individui infetti che abbiamo studiato (P = .02; figura 1A). Al contrario, nessuna correlazione è stata trovata tra il carico di DNA provirale dell’HIV-1 nelle cellule T CD4+ e la conta delle cellule T CD8+ (P = .34; figura 1B). Quando questi 2 parametri immunologici sono stati combinati ed espressi come rapporto cellule T CD4+:CD8+, è stata osservata una forte correlazione inversa tra questi valori e la frequenza di cellule T CD4+ portatrici di DNA provirale HIV-1 (P .01; figura 1C). Inoltre, 14 (74%) dei 19 pazienti con rapporto cellule T CD4+:CD8+ ,1.0 avevano carichi provirali di HIV-1 DNA <1000 copie/µg di DNA genomico derivato dalle cellule T CD4+. Al contrario, 10 (77%) dei 13 pazienti con rapporto cellule T CD4+:CD8+ >1.0 avevano carichi provirali di HIV DNA di ,1000 copie/mg di DNA genomico derivato dalle cellule T CD4+ (P = .01; figura 1C).

Correlazione tra la frequenza delle CTL HIV-1-specifiche e i parametri immunologici e virologici. È stato dimostrato che la frequenza dei CTL HIV-1-specifici diminuisce gradualmente dopo l’inizio della HAART negli individui infetti da HIV-1 a causa della diminuzione della disponibilità di antigeni HIV-1. Abbiamo studiato la relazione tra la frequenza dei CTL HIV-1-specifici e il rapporto cellule T CD4+:CD8+ in individui infetti che avevano risposto con successo alla HAART per periodi di tempo prolungati. Non è stata trovata alcuna correlazione statisticamente significativa tra le frequenze dei CTL che hanno risposto ai peptidi HIV-specifici derivati dai geni gag, pol, env e nef e i rapporti cellule T CD4+:CD8+ (figura 2). Inoltre, non è stata trovata alcuna correlazione statisticamente significativa tra il numero di CTL HIV-1-specifici e la conta delle cellule T CD4+ e CD8+ e il numero di cellule T CD4+ che trasportano il DNA provirale HIV-1 (dati non mostrati). Da notare, c’era una tendenza verso un numero più alto di CTL in individui con rapporti di cellule T CD4+:CD8+ più bassi.

Discussioni

L’uso diffuso della HAART nel trattamento della malattia HIV-1 ha portato a un drammatico miglioramento del risultato clinico. Sebbene la viremia plasmatica possa essere mantenuta al di sotto del limite di rilevazione in molti individui infetti che ricevono la HAART, la persistenza di bassi livelli di replicazione virale in corso nelle cellule T CD4+ ha rappresentato un grosso ostacolo al raggiungimento dell’eradicazione dell’HIV-1. Infatti, la persistenza di bassi livelli di replicazione virale è ritenuta il fattore principale coinvolto nel mantenimento della riserva di HIV-1, come si riflette nella frequenza di cellule T CD4+ portatrici di DNA provirale di HIV-1 in pazienti la cui viremia plasmatica è stata soppressa dalla HAART al di sotto del livello di rilevazione dei test standard. Inoltre, i livelli sostenuti di elevata conta di cellule T CD8+ sono stati osservati in un’alta percentuale di pazienti infetti che ricevono la HAART. A questo proposito, è stato suggerito che la replicazione virale attiva è responsabile dei livelli elevati di cellule T CD8+ e che i livelli di espressione del marcatore di attivazione CD38 su queste cellule hanno dimostrato di essere un marcatore prognostico di progressione della malattia in assenza di una terapia antivirale efficace.

Nonostante la mancanza di dati pubblicati, è stato ipotizzato che i rapporti invertiti delle cellule T CD4+:CD8+ nel sangue periferico di individui infetti che sono trattati con successo con la HAART siano dovuti a bassi livelli di replicazione virale in corso. Nel presente studio, abbiamo esaminato se i rapporti invertiti delle cellule T CD4+:CD8+ in alcuni individui infetti che ricevono la HAART per periodi di tempo prolungati fossero dovuti alla soppressione incompleta della replicazione dell’HIV-1, come riflesso dalle dimensioni della riserva di DNA provirale dell’HIV-1 nelle cellule T CD4+. La presenza persistente del DNA provirale di HIV-1 nel compartimento delle cellule T CD4+ in pazienti infetti che ricevono la HAART è stata descritta in modo convincente altrove ed è stata pensata per riflettere l’inibizione incompleta della replicazione virale residua in corso, nonostante la soppressione della viremia plasmatica a livelli non rilevabili. Abbiamo dimostrato una forte correlazione inversa tra la frequenza di cellule T CD4+ infette che contengono il DNA provirale dell’HIV-1 e i rapporti tra cellule T CD4+ e CD8+, suggerendo che i bassi livelli di replicazione virale residua possono essere in parte responsabili dei rapporti anomali tra cellule T CD4+:CD8+ nel sangue periferico.

Anche se la frequenza di cellule T CD4+ che trasportano il DNA provirale dell’HIV-1 può essere direttamente associata ai rapporti tra cellule T CD4+:CD8+, altri fattori possono influenzare questo rapporto. Parametri come l’esistenza di serbatoi virali sconosciuti che sostengono la replicazione virale attiva in presenza di HAART, anomalie nel sistema immunitario dell’ospite, la potenza di determinati regimi terapeutici o altri fattori di confondimento possono avere un effetto su entrambi i rapporti cellule T CD4+: CD8+ e il carico di DNA provirale nel compartimento delle cellule T CD4+. Da notare che i nostri dati suggeriscono che la replicazione virale in corso a livelli che non sono rilevabili dai test standard per la viremia plasmatica ma che mantengono la riserva di cellule T CD4+ dell’HIV-1, anche se sufficienti a impedire la normalizzazione dei rapporti tra cellule T CD4+ e CD8+ nei pazienti esaminati in questo studio, non sono sufficienti a mantenere le risposte CTL HIV-1 specifiche: CD8+ nei pazienti esaminati in questo studio, non sono sufficienti a mantenere le risposte CTL HIV-1-specifiche.

Si potrebbe sostenere che i rapporti anormali sostenuti delle cellule T CD4+:CD8+ negli individui infetti che ricevono la HAART per periodi prolungati potrebbero anche essere attribuiti a fattori sia immunologici che virologici. A questo proposito, è stato dimostrato che, in assenza di progressione della malattia e di un sufficiente recupero delle cellule T CD4+, l’omeostasi delle cellule T totali è mantenuta negli individui infetti da livelli elevati di cellule T CD8+ che possono, a loro volta, interferire con la rigenerazione delle cellule T CD4+. Tuttavia, non abbiamo trovato una correlazione tra i livelli di cellule T CD4+ portatrici del DNA provirale dell’HIV-1 e la conta delle cellule T CD8+.

Infine, studi precedenti hanno dimostrato che la generazione di cellule T CD4+ nel timo è gravemente ostacolata dalle conseguenze dirette o indirette della replicazione virale attiva. A questo proposito, sono stati dimostrati livelli diminuiti di output timico, come misurato dalla frequenza di cellule T CD4+ naive che portano cerchi di escissione del recettore delle cellule T, in individui infetti. Sebbene non sia chiaro se i precursori delle cellule T CD4+ siano infettati dall’HIV-1 nel timo, i nostri dati suggeriscono fortemente che la soppressione incompleta della replicazione virale negli individui infetti che ricevono la HAART continua a diffondere l’infezione nel compartimento delle cellule T CD4+ nel sangue periferico, con conseguente mantenimento del serbatoio di cellule T CD4+ per l’HIV-1.

Riconoscimenti

Ringraziamo Paul Parks per aver programmato le visite dei pazienti, Susan Moir per aver letto questo manoscritto e per le utili discussioni, e i pazienti per la loro partecipazione a questo studio.

Figures and Tables