Rilevamento in laboratorio e identificazione delle specie di Aspergillus mediante osservazione microscopica e coltura: l’approccio tradizionale

Riconoscimento delle caratteristiche morfologiche

Siccome gli aspergilli sono onnipresenti in natura, possono comunemente contaminare campioni e terreni di coltura. Di conseguenza, determinare il significato di Aspergillus spp. che cresce in coltura è spesso una sfida quando l’esame microscopico del campione è negativo. In un’indagine sugli isolati di Aspergillus dai destinatari di trapianti di fegato e reni, Brown et al. hanno scoperto che la presenza di più di due colonie in una coltura e l’infezione in più di un sito predicevano un’infezione significativa. Nei pazienti granulocitopenici con leucemia acuta, un singolo isolamento da un campione respiratorio inferiore deve essere considerato significativo. Rapporti inequivocabili delle osservazioni di laboratorio al medico possono ridurre il dilemma diagnostico. Per esempio, la dichiarazione: “Un totale di tre colonie di Aspergillus fumigatus isolate su due delle tre piastre” fornisce più informazioni di “Raro A. fumigatus isolato”.

Ottimizzare i risultati della coltura

L’isolamento in coltura e l’identificazione fenotipica dei comuni isolati clinici di Aspergillus spp. è solitamente facile e veloce. Tuttavia, la coltura è spesso descritta come lenta, creando forse idee sbagliate sul suo valore per il rilevamento degli aspergilli. A. fumigatus è un coltivatore rapido. Le tipiche colonie velutinose, grigio-blu-verdi e le teste conidiali uniseriate si sviluppano entro 24-48 ore su entrambi i supporti fungini e sull’agar sangue di pecora comunemente usato per la coltura batterica. Altri aspergilli associati all’aspergillosi invasiva, in particolare A. flavus, A. niger, A. nidulans e A. terreus hanno tassi di crescita simili a quelli di A. fumigatus quando le colonie sono state misurate su agar di estratto di malto e agar di lievito Czapek dopo un’incubazione di sette giorni a 25°C e 37°C. Poiché la resistenza ai farmaci di alcuni Aspergillus spp. è una minaccia, l’identificazione completa, non solo di A. fumigatus, ma anche delle specie meno comunemente isolate, è garantita. Gli scienziati di laboratorio devono anche riconoscere gli isolati atipici di Aspergillus spp. Recentemente sono stati riportati ceppi scarsamente sporulanti (bianchi) di A. fumigatus con una ridotta suscettibilità a diversi farmaci antifungini. Questi ceppi bianchi hanno una sequenza genetica diversa da quella del wild-type, A. fumigatus Fresenius, e non sono riusciti a sviluppare le tipiche teste conidiali blu-verdi fino a 10-12 giorni dopo l’incubazione. Un’altra sfida è la muffa bianca, Neosartorya fisheri, che inizialmente produce teste conidiali rade, simili a quelle di A. fumigatus. Tuttavia, N. fisheri sviluppa successivamente numerosi cleistoteci rotondi a parete sottile, rendendo semplice la differenziazione da A. fumigatus. Un cannocchiale da dissezione è utile per localizzare rapidamente le teste dei conidi e i cleistoteci. Possono verificarsi isolati sterili, bianchi, a crescita rapida o glabri, ammassati, a crescita lenta di A. fumigatus, che richiedono la termotolleranza e il test dell’esoantigene per l’identificazione definitiva. Khan et al. hanno riportato un A. atipico. terreus isolato da campioni delle vie respiratorie inferiori di un paziente con aspergilloma. Le colonie iniziali erano arancioni e producevano un pigmento giallo diffusibile e piccole cellule singole che venivano confuse con i conidi di Scedosporium apiospermum. Gli anticorpi precipitanti e le teste conidiali tipiche di A. terreus prodotte dopo 10 settimane di incubazione hanno confermato l’identificazione.

Le immagini e le informazioni disponibili nei libri di testo e su Internet offrono buone opportunità educative per imparare a identificare Aspergillus spp. Il CDC, il National Laboratory Training Network (NLTN) e la CBS offrono workshop di laboratorio. Quando il viaggio fuori sede non è pratico, i laboratori sono incoraggiati a utilizzare il tutorial online, Aspergillus Reference Cultures, per la formazione interna. Gli organismi di riferimento elencati sono disponibili per l’acquisto dalle principali collezioni di colture.

Analizzare ogni fase della procedura di coltura può portare a un migliore recupero degli aspergilli. La liquefazione dei campioni con Sputolisina o altri agenti mucolitici è stata suggerita per il recupero di funghi intrappolati nel muco dell’espettorato e nel materiale del seno recuperato dalla chirurgia endoscopica. L’uso di destrosio di patate, fiocco di patate, estratto di malto, agar di muffa inibitorio, o agar di sporulazione simili come mezzi di isolamento primario per Aspergillus spp. può accelerare il tasso di crescita e la produzione di conidi. L’aggiunta di agenti antibatterici ai terreni di isolamento aiuta a ridurre il tempo di identificazione inibendo la crescita eccessiva dei batteri e riducendo la necessità di subcultura. L’incubazione iniziale dei mezzi fungini a 35-37°C invece di, o in aggiunta a, 30°C può accelerare la crescita di alcuni aspergilli. Allo stesso modo, l’ispezione quotidiana dei terreni di coltura assicura il rilevamento più precoce possibile. Incubando le piastre di coltura in un ambiente microaerofilo a 35 °C, Tarrand ha scoperto che Aspergillus spp. selezionati e clinicamente importanti crescevano da 12 su 12 colture in brodo. Le colture degli stessi organismi incubate a 25 °C senza CO2 non hanno dato risultati positivi. Ulteriori studi sarebbero utili per chiarire i mezzi e le condizioni più efficaci per il recupero e l’identificazione rapida di aspergilli clinicamente importanti.

Con un rapido scotch-tape o un montaggio di tease, le teste conidiali di Aspergillus spp. possono tipicamente essere identificate. Tuttavia, una coltura su vetrino può essere necessaria quando la sporulazione è lenta o atipica. Il ritmo rapido della maggior parte dei laboratori ospedalieri impone il metodo più semplice, anche se non necessariamente il più raffinato, per eseguire la coltura su vetrino. Il classico metodo di coltura su vetrino di Riddell è stato integrato con altre tecniche meno laboriose. Un metodo rapido è semplicemente quello di spingere un vetrino coprioggetto di 18 × 18 mm con un angolo di 45 gradi in un mezzo di sporulazione, come l’agar fiocco di patate. Quando la muffa sporula, il coprioggetto viene accuratamente ritirato dall’agar e montato in una goccia di blu di lattofenolo o lattofucsina su un vetrino da microscopio. Un’altra goccia viene posta sopra il piccolo vetrino coprioggetto prima di completare il montaggio con un vetrino coprioggetto da 22 × 22 mm.

Problemi di forza lavoro

La diagnosi rapida dell’aspergillosi dipende non solo dal miglioramento della metodologia ma anche da una forza lavoro adeguata e ben formata. Le indagini sulle pratiche micologiche raccomandano fortemente una maggiore formazione. Un’enfasi particolare dovrebbe essere posta sull’identificazione accurata, sull’esame diretto, sull’uso appropriato dei media, sulla rilevanza clinica e sull’efficacia dei costi. Tuttavia, l’inadeguatezza del personale può compromettere sia la formazione che l’implementazione di procedure più clinicamente rilevanti. L’indagine ASM Benchmarking ha rivelato una carenza continua di personale per alcuni laboratori di microbiologia negli Stati Uniti. In parte, la carenza deriva da una riduzione del 53%-56% dei programmi di formazione CLS negli ultimi 12 anni. Il 34% dei professionisti che lavorano nei laboratori di microbiologia oggi hanno più di 50 anni. Saranno disponibili lavoratori più giovani per sostituirli quando andranno in pensione? Mentre quasi l’80% delle donne nella forza lavoro sono più giovani di 30 anni, solo il 10% delle lavoratrici nei laboratori di microbiologia hanno meno di 30 anni. Questi dati suggeriscono che la carenza di forza lavoro continuerà e forse si aggraverà.

Conclusione

Il miglioramento delle procedure diagnostiche tradizionali e non tradizionali per le micosi richiede sforzi simultanei per garantire una forza lavoro adeguata e per migliorare la mobilità della carriera, il riconoscimento professionale, le opportunità di formazione avanzata, la compensazione e altri fattori necessari per stimolare l’interesse per le scienze di laboratorio.