Dalla scoperta dei principi base della clonazione molecolare, sono state sviluppate diverse strategie di clonazione per migliorare la facilità e la velocità con cui i frammenti di DNA possono essere ricombinati. Leggi le strategie più comuni usate nel clonaggio molecolare o ottieni il tuo gene desiderato nel vettore che vuoi nel modo più semplice con i cloni GenEZ™ ORF. Inizia con la ricerca del tuo gene.
Clonazione tradizionale
La clonazione tradizionale, chiamata anche clonazione PCR, richiede l’uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare la sequenza template di interesse (di solito il gene di interesse) e aggiungere siti di restrizione alle estremità della sequenza. Gli enzimi di restrizione sono usati per tagliare sia il modello di interesse che il vettore di destinazione, e la DNA ligasi è usata per unire le estremità appiccicose del modello e del vettore insieme. La clonazione tradizionale permette una manipolazione flessibile della sequenza del DNA, che facilita la costruzione di quasi tutti i costrutti desiderati. Tuttavia, i punti di controllo e le procedure di ottimizzazione richieste per il clonaggio tradizionale possono essere ingombranti, e i reagenti richiesti possono essere costosi.
Clonazione AT
La clonazione AT è una delle forme più semplici di clonazione. In questo metodo, i vettori che contengono 5′ timina sono usati per accettare prodotti PCR in cui sono state aggiunte ulteriori 3′ adenosine dalla natura dell’amplificazione della polimerasi TAQ. Il clonaggio TA ha il vantaggio della facilità e della velocità, dato che non è richiesta alcuna fase di digestione di restrizione. Inoltre, i kit di clonazione TA contengono tamponi di reazione che contengono il vettore premiscelato, la ligasi e il buffer, riducendo il tempo di reazione di legatura a soli 5 minuti. Lo svantaggio della tecnologia di clonazione TA è che la clonazione non è direzionale, il che significa che il gene di interesse può essere inserito nel vettore bersaglio con orientamento senso o antisenso. Normalmente, metà dei trasformanti successivi conterrà il gene nella direzione del senso e metà conterrà il gene nella direzione dell’antisenso. Tuttavia, le cellule trasformate con geni tossici possono mostrare tutti i geni in direzione antisenso, poiché le cellule che contengono i geni orientati in senso non sopravviveranno. Inoltre, le cellule sopravvissute che contengono geni tossici orientati nella direzione del senso possono essere mutate per codificare una proteina meno tossica.
Seamless cloning
Le tecnologie di clonazione senza saldatura eliminano il requisito degli enzimi di restrizione. Questo può essere vantaggioso quando un inserto contiene un certo numero di siti di restrizione nella sua sequenza, rendendo difficile identificare gli enzimi di restrizione che non taglieranno il gene di interesse durante la procedura di clonazione. Il clonaggio senza soluzione di continuità sfrutta la ricombinazione omologa e ci sono numerose varianti di questa tecnica. In generale, la procedura consiste nell’aggiunta di sequenze di affiancamento di circa 15 bp di lunghezza sia all’inserto che al vettore tramite PCR. Le esonucleasi vengono utilizzate per masticare le sequenze dell’inserto e del vettore e il DNA viene unito utilizzando enzimi ricombinatori o DNA ligasi. Il clonaggio senza soluzione di continuità è stato semplificato dallo sviluppo di kit che contengono già il vettore target e un mix proprietario di enzimi necessari per la reazione di ricombinazione. Per esempio, il GenBuilder™ Kit di GenScript può clonare inserti fino a 10 kb in 30 minuti e può essere usato anche per progetti di clonazione ad alta produttività.
