Struttura della soluzione, struttura di risoluzione, specificità dei glicani e attività inibitoria della fenolossidasi delle lectine di tipo C CTL4 e CTLMA2 di Anopheles

Conservazione di CTL4/CTLMA2 in Anopheles

CTL4 e CTLMA2 sono entrambi composti da un peptide di segnale, una breve sequenza N-terminale contenente il motivo CXCXC e un singolo dominio CTL. Un rapporto recente ha suggerito che la funzione di CTL4 e CTLMA2 o i loro cofattori hanno divergenti all’interno Anopheles, e in particolare che An. albimanus CTL4 non contiene i residui di cisteina N-terminale coinvolti in legami disolfuro22. Abbiamo prima riesaminato gli ortologhi di CTL4 (AGAP005335) e CTLMA2 (AGAP005334), che hanno uno stretto orientamento back-to-back sul cromosoma 2L (Fig. 1a), utilizzando i modelli di gene corrente (a febbraio 2019) in Vectorbase24. Abbiamo trovato proteine con un motivo CXCXC N-terminale per 15/16 ortologhi CTL4, incluso An. albimanus AALB014534, e 13/14 ortologhi CTLMA2. Abbiamo eseguito allineamenti multipli di sequenza di CTL4 e CTLMA2 da 10 specie di Anopheles asiatiche, africane e del Nuovo Mondo (Fig. 1b). Gli alberi filogenetici non radicati hanno una topologia quasi identica, e un albero filogenetico combinato ha due rami simmetrici, tranne per la posizione di An. dirus rispetto a An. funestus e An. maculatus.

Questo supporta l’ipotesi che CTL4 e CTLMA2 sono conservati all’interno del genere Anopheles, con ortologhi mancanti che riflettono l’annotazione incompleta di alcuni genomi. Abbiamo esaminato la regione genomica di tre specie con un ortologo CTL4 riportato ma nessun ortologo CTLMA2: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, e An. melas AMEC014491. Tutti possiedono un gene vicino o sovrapposto con orientamento inverso – ASTE002636, AMIN007379 e AMEC088499, che comprende due domini CTL. Per An. stephensi e An. minimus il secondo CTL è preceduto da un motivo CXCXC, suggerendo che possono essere ortologhi CTLMA2. Nelle zanzare Aedes e Culex, la situazione è meno chiara. Un ortologo CTLMA2 che include un motivo CXCXC N-terminale è annotato in Ae. albopictus, AALF001196, e ha un vicino gene a due esoni invertiti back-to-back AALF001195, composto da una serina proteasi e un dominio CTL. Il modello genico di ottobre 2018 per Ae. aegypti include un ortologo CTLMA2 con motivo CXCXC N-terminale, CTLMA14 (AAEL014382), attualmente elencato come un ortologo CTL4). Un ortologo CTLMA2 è annotato in C. quinquefasciatus, CPIJ000443, ma manca del motivo N-terminale CXCXC. Questo suggerisce che CTLMA2 è sorto in un antenato comune di Anopheles e Aedes mentre CTL4 può essere specifico di Anopheles.

caratterizzazione biochimica

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 e CTLMA2 CRDs (Fig. S1a), e An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) sono stati espressi in cellule di insetti utilizzando il sistema vettore di espressione baculovirus (BEVS) e purificato per omogeneità. AgCTL4 maturo (25-177) ha una massa molare di 17,3 kDa e pI 7,7. AgCTLMA2 maturo (18-174) ha una massa molare di 17,9 kDa e pI 4,5. L’eterodimero purificato ha un peso molecolare su SDS-PAGE non riducente (NR) di 35 kDa (Fig. 2a) ed eluisce come un singolo picco sulla cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) con un peso molecolare apparente di 40 kDa (Fig. 2b). CTL4 monomerico e CTLMA2 appaiono su SDS-PAGE riducente a 17 kDa e 20 kDa, rispettivamente. Come precedentemente notato, l’aumento del peso molecolare apparente di CTLMA2 può riflettere la sua insolita (acido) distribuzione aminoacidica20.

È stato dimostrato che An. gambiae CTL4/CTLMA2 è stabilizzato da un disolfuro intermolecolare tra le cisteine del motivo CXCXC N-terminale; mutazione di queste tre cisteine in alanina abroga la formazione di disolfuro interchain20. Per perfezionare ulteriormente la posizione del disolfuro intercatena, abbiamo costruito nove mutanti contenenti una singola cisteina nel motivo CXCXC N-terminale di CTL4 e CTLMA2, co-espresso le proteine in cellule Sf9, ed eseguito Western Blotting per rilevare CTL4 e CTLMA2. La formazione di disolfuro intermolecolare era inefficiente ma evidente su SDS-PAGE non riducente in tutti i casi (Fig. 2c).

Questo suggerisce che la formazione di disolfuro intermolecolare N-terminale tra CTL4 e CTLMA2 è promiscua, piuttosto che coinvolgere un residuo di cisteina specifico da ciascuna proteina. Se la formazione intermolecolare del disolfuro è promiscua, gli eterodimeri CTL4/CTLMA2 potrebbero in linea di principio formare oligomeri multivalenti con legame disolfuro. Tuttavia, nessun oligomero legato al disolfuro viene rilevato su NR-SDS-PAGE per An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Fig. 2a). Allo stesso modo, mentre CTL4 e CTLMA2 possono formare omodimeri con legame disolfuro in vitro20, il prodotto purificato è in gran parte (>95%) eterodimero. Alcune bande minori (~10%) sono osservate su NR-SDS-PAGE per An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) che possono rappresentare la formazione di omodimero o oligomero.

Sia An. gambiae CTL4/CTLMA2 che An. albimanus CTL4/CTLMA2 sono polidispersi in soluzione. Higher-order non-covalente oligomerizzazione è evidente come una spalla del picco principale in SEC con l’aumento della concentrazione, ed è più pronunciato per An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Abbiamo confermato l’esistenza di specie oligomeriche mediante ultracentrifugazione analitica a velocità di sedimentazione (AUC) (Fig. 2d). A pH 7.5 una serie di specie di intensità decrescente si osserva nella distribuzione c (s): s1 = 3.1 s, s2 = 4.4 s, s3 = 5.9 s. Oligomerizzazione è indipendente da Ca2 + per A. gambiae CTL4/CTLMA2 ma aumenta sostanzialmente con Ca2 + per A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), e non è correlata al pH secondo la dispersione dinamica della luce (DLS) (Fig. 2e).

Calcio vincolante

Come CTL, sia CTL4 che CTLMA2 possono legare il calcio. Tuttavia, i residui canonici di legame al Ca2+ in CTL4 sono mutati, suggerendo che potrebbe essere un CTLD ma non un CRD di tipo C. Quindi, abbiamo misurato l’affinità di legame al calcio di An. gambiae CTL4, CTLMA2 e l’eterodimero CTL4/CTLMA2 di An. gambiae e An. albimanus mediante calorimetria a titolazione isotermica (ITC). In condizioni equivalenti, il legame è stato osservato per CTLMA2 e CTL4/CTLMA2, ma non per CTL4 (Fig. 3a-c). Costanti di legame e parametri termodinamici sono stati calcolati dai risultati di tre esperimenti indipendenti (Tabella 1). CTLMA2 Ca2 + legame è ben adattato da un modello unico sito con KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal / mol. L’affinità di An. gambiae CTL4/CTLMA2 per il calcio è ~ 40 × superiore a CTLMA2 con KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) ha una affinità simile per il calcio con KD = 2.82 μM, ΔH = -12.1 kcal/mol. Tuttavia, il legame del calcio sia per An. gambiae e An. albimanus CTL4/CTLMA2 era sub-stoichiometrico (N = 0,36-0,50).

Legame ai glicani

CTL4 e CTLMA2 appartengono alla stirpe dei CTL mieloidi – tra cui il recettore del mannosio dei macrofagi (MMR) e DC-SIGN – che formano una famiglia conservata di recettori immunitari nei metazoi15,25. Tra i CTL con struttura nota, CTLMA2 ha il 30% di identità di sequenza al dominio di riconoscimento dei carboidrati (CRD) del recettore scavenger del topo (SCRL, PDB ID 2OX9)26 e della proteina surfattante D del maiale (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 conserva i residui associati con Ca2 + legame nel ciclo di legame glicano, e il motivo EPN canonico associato con D-mannosio selettività (Fig. 4a). Al contrario, CTL4 manca di tutti i residui associati al legame Ca2+, coerentemente con il fatto che nessun legame è stato osservato da ITC. L’unica CTL di struttura nota con una notevole somiglianza con CTL4 è il fattore IX/X binding protein (X-bp) dal veleno del mocassino cinese Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp è una CTLD modificata in cui il dominio di legame ai glicani è sostituito da un lungo anello che media la dimerizzazione per generare il sito di legame al fattore IX/X. Quindi, sebbene alcuni CTL degli insetti non richiedano il calcio per il legame dei glicani, non è chiaro se CTL4 debba legare affatto i glicani.

Al fine di definire la loro attività di lectina, abbiamo analizzato CTL4, CTLMA2 e l’eterodimero CTL4/CTLMA2 su matrici di glicano che mostrano 367 strutture uniche di glicano28. Questi studi hanno dimostrato il legame a una gamma di glicani (tabella 2). I monomeri di CTL4 e CTLMA2 hanno dimostrato il legame a solo quattro e sei glicani, rispettivamente, mentre l’eterodimero legato 18 diversi glicani. C’è una differenza apprezzabile tra i ligandi legati dai singoli monomeri e dall’eterodimero; 3/4 (75%) dei glicani riconosciuti da CTL4 e 2/6 (33%) dei glicani riconosciuti da CTLMA2 non erano riconosciuti da CTL4/CTLMA2.

Per confermare i risultati dell’array di glicani e per determinare le preferenze di legame dei CTL, è stata eseguita l’analisi SPR (Tabella 3). In quasi tutte le interazioni il glycan array e la SPR erano in accordo per la presenza di interazioni con la SPR che indicava che il glycan array aveva quattro risultati falsi negativi: CTLMA2 monomero con H-antigene, condroitina solfato e condroitina-6-solfato, e CTL4 monomero con condroitina-6-solfato. Tuttavia, tutti i risultati falsi negativi hanno mostrato il legame sull’array con l’eterodimero CTL4/CTLMA2.

I CTL non hanno riconosciuto i glicani contenenti mannosio, ad eccezione del mannosio-6-fosfato da parte di CTL4/CTLMA2, nonostante il motivo EPN canonico presente in CTLMA2. Piuttosto, le strutture riconosciute sono generalmente motivi di glicosaminoglicani (GAG) che comprendono legami β1-3/β1-4 tra glucosio (Glc), galattosio (Gal) e le rispettive esosammine GlcNac e GalNac. Il legame Galβ1-4Glc era presente in 12/23 (52%) dei glicani riconosciuti, compresi 6/23 (26%) contenenti Galβ1-4GlcNac e 4/23 (17%) contenenti il motivo keratan Galβ1-4GlcNac β1-3Gal o GlcNac β1-3Galβ1-4Glc. Dei quattro glicani riconosciuti da CTL4, il colpo più forte è stato per il globopentaosio (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 ha anche legato HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n e β1-3Glucano (Glcβ1-4Glc)n. Tre dei cinque glicani riconosciuti dal monomero CTLMA2 erano solfati, e l’eterodimero CTL4/CTLMA2 ha riconosciuto il solfato di condroitina e il solfato di condroitina-6, l’acido ialuronico (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8, e HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Questi risultati suggeriscono che ci sono effetti distinti e sinergici dell’eterodimerizzazione sul legame dei glicani.

Sia CTLMA2 che l’eterodimero CTL4/CTLMA2 riconoscono diversi zuccheri contenenti fucosio, compresi sialyl-LewisX e sulfo-LewisA ma non sialyl-LewisA. La massima affinità di legame è stata osservata per sulfo-LewisA con il legame al complesso CTLMA2 (106 nM) e CTL4/CTLMA2 (95 nM) ad un KD di ~100 nM (Tabella 3). Il più alto legame di affinità osservato per CTL4 era anche ad un glicano solfato, sulfo-lactosamina (292 nM).

Analisi strutturale

Per sondare ulteriormente la struttura di CTL4 e CTLMA2, abbiamo generato modelli strutturali di CTL4 e CTLMA2 (Fig. 4b) usando MODELLER29 con ulteriori modifiche manuali. Sia CTL4 che CTLMA2 hanno un loop esteso (loop 1) che segue la seconda elica del CTLD (Fig. 4a) con un’alta densità di residui carichi complementari; residui basici per CTL4 e residui acidi per CTLMA2. L’elettrostatica complementare di questi residui del loop 1 e la loro vicinanza al motivo N-terminale CXCXC suggeriscono che questa sia una potenziale interfaccia proteina/proteina all’interno dell’eterodimero (Fig. 4b), per la quale è stato generato un modello ipotetico con un singolo legame disolfuro nel motivo CXCXC. Tuttavia, gli anelli di legame glicano/Ca2+ sono una seconda interfaccia potenziale, come osservato per le due catene di D. acutus X-bp. L’ipotesi alternativa è che i due domini CTL siano indipendenti l’uno dall’altro, con linker flessibili che li uniscono attraverso l’ipotesi intermolecolare.

Per testare questa ipotesi, abbiamo analizzato la struttura della soluzione di CTL4/CTLMA2 tramite la diffusione di raggi X a piccolo angolo (SAXS). Gli esperimenti sono stati condotti in 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9.0, 0,5 mM CaCl2, e 1% glicerolo per minimizzare le interazioni interparticella. In queste condizioni, la proteina ha mostrato una relazione lineare tra l’intensità estrapolata ad angolo zero e la concentrazione (I0 vs. c) fino ad una concentrazione di 3,1 mg/ml. Il buffer-sottratto curva di intensità I vs. q (Fig. 4c) è stato sottoposto a SAXSMoW2 che produce RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) e MW peso molecolare = 39 kDa, solo l’11% superiore al MW previsto eterodimero di 35 kDa30. Tuttavia, la trama Guinier calcolato si basa su solo sette punti di dati; montaggio su un intervallo esteso (Fig. 4c, inserto) produce RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), mentre il montaggio della funzione di distribuzione pairwise P (r) (Fig. 4d) produce un RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). La distribuzione P(r) adattata da DAMMIF31 con 20 modelli ab initio tallone con una media normalizzata discrepanza strutturale NSD = 1,0 ± 0,2. Il corpo principale dei modelli ab initio sono simili nella forma al previsto CTL4/CTLMA2 eterodimero.

Densità supplementare si estende dal corpo principale dei modelli tallone che può riflettere sia la sequenza N-terminale di entrambe le proteine tra cui il motivo CXCXC, o una popolazione minore di CTL4/CTLMA2 con un raggio di rotazione più alto. Per testare questa ipotesi abbiamo eseguito la modellazione multi-stato del profilo SAXS con il programma MULTIFOXS32. Abbiamo generato un modello completo per CTL4-6xHis/CTLMA2 con una coiled-coil N-terminale terminata da un disolfuro intermolecolare tra CTL4 C39 e CTLMA2 C34. MULTIFOXS ha generato un insieme di 10.000 varianti del modello da confrontare con la curva di dispersione sperimentale. Gli unici residui flessibili erano CTL4 40-45 e 178-183 (6xHis) e CTLMA2 35-39, con una bobina a spirale N-terminale che serve come corpo rigido che collega le due catene. Il miglior modello a uno stato si adatta ai dati con χ2 = 1.13 e aveva RG = 23.7 Å. Il minimo χ2 = 1.07 è stato raggiunto con un modello a 3 stati (Fig. 4e), in cui l’80% della dispersione è contribuito da due modelli compatti con RG = 22.0 Å e RG = 23.7 Å. Questi dati sono coerenti con la formazione di un eterodimero compatto tra CTL4 e CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 inibiscono l’attivazione della fenolo ossidasi in risposta a E. coli

CTL4 e CTLMA2 funzionano come inibitori della risposta di melanizzazione della zanzara all’infezione. È stato precedentemente riportato che CTL4 knockdown non ha portato ad un aumento dell’attività di fenolo ossidasi (PO) in risposta all’infezione con una miscela di E. coli e S. aureus20. Lo stesso studio, tuttavia, ha trovato che le zanzare dsCTL4 e dsCTLMA2 erano specificamente sensibili ai batteri Gram-negativi. Quindi, abbiamo riesaminato l’effetto di CTL4 e CTLMA2 knockdown su emolinfa PO attività in risposta a solo E. coli infezione (Fig. 5a). A 4 h dopo l’infezione con E. coli, l’attività PO è stata significativamente migliorata per dsCTL4 (p = 0,02) e dsCTLMA2 (p = 0,004) zanzare rispetto ai controlli dsLacZ (Fig. 5b). L’efficienza media knockdown per CTL4 e CTLMA2 era 93 ± 3% e 89 ± 3%, rispettivamente, con >80% in ogni singolo esperimento.

Melanizzazione di Plasmodium ookinetes su CTL4/CTLMA2 silenziamento è dipendente da LRIM117,22, TEP133 e SPCLIP133. Poiché questi sono tutti elementi della risposta immunitaria simile al complemento TEP1, abbiamo pensato che l’attività PO potenziata in assenza di CTL4 dovrebbe essere TEP1-dipendente. Di conseguenza, abbiamo confrontato l’aumento dell’attività PO in zanzare dsCTL4 con co-somministrazione di dsTEP1 alla co-somministrazione di dsLacZ (Fig. 5c). L’efficienza media knockdown per TEP1 era 82 ± 9% e >80% in 5/6 esperimenti (64% in un esperimento). Infatti, non c’era alcun miglioramento significativo di attività PO in zanzare dsCTL4 quando TEP1 è stato anche silenziato. Questo conferma che la melanizzazione in assenza di CTL4/CTLMA2 è TEP1-dipendente.

La co-somministrazione di CTL4/CTLMA2 ricombinante con E. coli ha invertito significativamente l’aumento dell’attività PO nelle zanzare dsCTL4 rispetto al BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Questi risultati dimostrano che CTL4/CTLMA2 è direttamente coinvolto come regolatore negativo dell’attività PO. Nelle zanzare dsLacZ tuttavia, CTL4/CTLMA2 non ha soppresso l’attività PO indotta da E. coli rispetto alla sieroalbumina bovina (BSA). Inoltre, l’attività PO indotta da E. coli nelle zanzare dsCTL4 coiniettate con CTL4/CTLMA2 ricombinante (dsCTL4 + CTL) era superiore a quella delle zanzare dsLacZ coiniettate con BSA (dsLacZ + BSA). Quindi, l’iniezione di CTL4/CTLMA2 ricombinante non salva completamente la perdita della proteina endogena.