1 Introduzione
il ripiegamento e la stabilità del tRNA sono cruciali per una traduzione efficiente, e difetti in entrambe le proprietà possono portare a quantità ridotte di tRNA, con conseguenti difetti di crescita nel lievito e malattie nell’uomo (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). Nel lievito Saccharomyces cerevisiae, ci sono due principali vie di controllo della qualità cellulare note per degradare le specie di tRNA difettose. La prima via è la via di sorveglianza nucleare, che agisce sul pre-tRNA nel nucleo attraverso l’uso dell’esosoma nucleare e del complesso TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) degradando i pre-tRNAiMet privi della modifica m1A58 o con un trailer 3′ mal processato (Ozanick et al., 2009) e una frazione di pre-tRNA wild-type (WT) (Gudipati et al., 2012). Il secondo percorso è quello del decadimento rapido del tRNA (RTD), che degrada specifiche specie di tRNA maturi, ipomodificati o destabilizzati attraverso l’attività delle esonucleasi 5′-3′ Rat1 e Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD è elicitato in mutanti privi di una qualsiasi delle diverse modifiche nel corpo del tRNA o attraverso mutazioni destabilizzanti, e per tutti i substrati RTD identificati, la delezione di MET22 ripristina completamente i livelli di tRNA e la crescita (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). La soppressione di RTD nei ceppi met22Δ è presumibilmente dovuta all’inibizione delle esonucleasi Rat1 e Xrn1 dal metabolita 3′-fosfoadenosina-5′-fosfato, che ha livelli aumentati quando Met22 è inibito (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).
RTD è noto per agire su diverse specie specifiche di tRNA, che sono state identificate e studiate utilizzando sette approcci (Fig. 1). Il primo approccio è stato quello di utilizzare microarray per confrontare i livelli di tRNA su scala genomica in mutanti di modifica sensibili alla temperatura trm8Δ trm4Δ (privi di m7G46 e m5C) e in ceppi correlati in condizioni semipermissive. In questo modo, abbiamo identificato il substrato RTD tRNAVal(AAC), poiché aveva ridotto i livelli di tRNA nel mutante trm8Δ trm4Δ rispetto a WT o ai mutanti singoli corrispondenti (Alexandrov et al., 2006).
Figura 1. Diversi approcci utilizzati per identificare e analizzare i substrati RTD.
Nel secondo approccio, sono stati utilizzati i northern blot per esaminare sia il tasso che la specificità della degradazione del tRNA per i substrati RTD nei mutanti di modifica sensibili alla temperatura. In questo approccio, l’RNA isolato dalle cellule in diversi momenti dopo lo spostamento di temperatura è stato analizzato per i livelli di tRNA specifici. Da questa analisi, abbiamo scoperto che il 50% del tRNAVal(AAC) è stato degradato in un mutante trm8Δ trm4Δ entro 30 minuti di uno spostamento da 28 a 37 °C, mentre i tRNAiMet, tRNAMet, e tRNAPhe similmente ipomodificati non hanno mostrato alcuna diminuzione (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Inoltre, i livelli relativi di tRNA carichi e non carichi potevano essere misurati eseguendo il northern blot in condizioni acide, che ha mostrato che i livelli di tRNAVal(AAC) carichi erano ridotti del 50% entro 25 minuti dallo spostamento di temperatura in un mutante trm8Δ trm4Δ e che i livelli di tRNAVal(AAC) non carichi apparivano inalterati (Alexandrov et al, 2006).
Il terzo approccio è stato attraverso la soppressione del tRNA ad alta copia, in cui un plasmide ad alta copia che esprime un particolare tRNA è stato introdotto in un mutante sensibile alla temperatura di modifica del tRNA. Se il tRNA era un substrato RTD e la sensibilità alla temperatura era il risultato della degradazione di una singola specie di tRNA, allora la sovraespressione del tRNA avrebbe soppresso il difetto. Così, abbiamo trovato che la sensibilità alla temperatura di un mutante trm8Δ trm4Δ era soppressa da un plasmide ad alta copia che esprimeva tRNAVal(AAC), indicando che la sensibilità alla temperatura era dovuta principalmente alla perdita di tRNAVal(AAC), e che le modifiche mancanti erano importanti per la stabilità del tRNA (Alexandrov et al., 2006). Allo stesso modo, i substrati RTD di diversi altri mutanti di modifica del tRNA sono stati identificati utilizzando questo approccio, tra cui tRNASer(CGA) e tRNASer(UGA) nei mutanti tan1Δ trm44Δ (senza ac4C12 e Um44) e nei mutanti trm1Δ trm4Δ (senza m2,2G26 e m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).
In quarto luogo, abbiamo usato un approccio di sostituzione genetica per identificare i determinanti RTD nella famiglia tRNASer sostituendo il singolo gene essenziale tRNASer(CGA) (SUP61) con diverse varianti tRNASer(CGA) nel ceppo WT e met22Δ, e poi testando la crescita a diverse temperature. Usando questo approccio, abbiamo determinato che la stabilità combinata dell’accettore e dello stelo T erano forti determinanti per la suscettibilità RTD nella famiglia di geni tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Questa conclusione è stata ulteriormente supportata da un quinto approccio per misurare RTD, in cui abbiamo dimostrato in vitro che le varianti tRNASer(CGA) prive di ac4C12 e Um44, o con mutazioni destabilizzanti nello stelo accettore, erano più inclini alla digestione da parte di Xrn1 e più suscettibili alla rimozione del 5′ fosfato da parte della fosfatasi vitello-intestinale (Whipple et al, 2011).
In questa recensione, discuteremo i nostri approcci recentemente sviluppati sesto e settimo per lo studio dei substrati RTD, che si sono dimostrati estremamente prezioso per ampliare la nostra comprensione del percorso RTD. Il sesto approccio utilizza un reporter fluorescente per analizzare in modo completo le librerie di migliaia di varianti di tRNA nei ceppi WT e met22Δ. Attraverso questo approccio, abbiamo identificato 643 probabili candidati substrati di RTD, molti in regioni che non ci si aspettava di suscitare RTD sulla base del lavoro precedente (Guy et al., 2014). Mostreremo i dati che dimostrano che questo approccio può essere utilizzato per studiare la funzione tRNA in condizioni diverse e discuterà altre applicazioni dell’approccio.
Il settimo approccio impiega l’estensione del primer veleno per misurare i livelli di tRNA in un ceppo WT e met22Δ ed è prezioso nella sua capacità di misurare specificamente un tRNA variante anche in presenza del tRNA WT la cui sequenza può differire solo da un singolo residuo. Forniamo una metodologia dettagliata di questo approccio e discutere alcune delle sue altre possibili applicazioni.