Tumor Xenograft

Characterization of Xenograft Banks

Lavorare con i tumori PDX richiede la creazione e il mantenimento di una banca di tumori, che vengono impiantati nei topi e poi trasferiti in serie di generazione in generazione, a meno che questa catena di eventi sia interrotta dal congelamento dei campioni. Si pensa che i PDX riproducano le caratteristiche morfologiche del tumore originale più precisamente degli xenotrapianti di linee cellulari stabilite, in termini di profilo istologico e genetico. Riproducono l’eterogeneità dei tumori umani e hanno un valore migliore per predire la risposta al trattamento.8-16

Le lesioni infiammatorie sono generalmente facili da identificare con metodi istologici. Al contrario, per i tumori, può essere più difficile determinare se il tumore è quello previsto o ha un’origine diversa. Infatti, i tumori murini possono svilupparsi nel sito degli xenotrapianti. La maggior parte di questi tumori sono linfomi (Fig. 4.2B),11 ma a volte si osservano sarcomi a cellule fusiformi (Fig. 4.2C), e in rari casi si possono osservare anche altri tumori murini, come i tumori delle ghiandole mammarie nel tessuto sottocutaneo dei topi femmina. Tumori spontanei o lesioni simili ai tumori possono anche svilupparsi in organi distanti e possono essere erroneamente interpretati come possibili metastasi (per esempio, adenomi polmonari; Fig. 4.2D). Il semplice esame morfologico del tessuto generalmente indica chiaramente se il tumore è dello stesso tipo del tumore umano originale. Questo è particolarmente vero per la maggior parte degli xenotrapianti di carcinoma, che hanno una morfologia molto diversa da quella dei linfomi o dei sarcomi. I carcinomi sono generalmente formati da grandi cellule, chiaramente disposte in cordoni, tubuli o lobuli con un interstizio connettivo prominente. I linfomi (umani o murini) consistono in fogli di piccole cellule rotonde con scarso stroma, e i sarcomi consistono in flussi di cellule fusiformi. È quindi facile distinguere ad occhio tra questi diversi tipi di tumori. La diagnosi può essere più difficile se il tumore originale è un “tumore blu”, un tumore costituito da piccole cellule con pochissimo citoplasma e un nucleo ipercromatico, che appare profondamente basofilo (di colore blu) al microscopio a basso ingrandimento dopo la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E). I tumori blastici, come il retinoblastoma, sono tipicamente tumori blu. In questi casi, la morfologia del tumore può essere difficile da interpretare, soprattutto perché le caratteristiche più specifiche di alcuni tumori, come le rosette di molti tumori blastici, sono generalmente mancanti o scarsamente rappresentate negli xenotrapianti. I tumori anaplastici, dove le cellule tumorali hanno poca o nessuna somiglianza morfologica con le cellule normali, possono anche essere difficili da caratterizzare senza tecniche ausiliarie. Come detto, mentre è relativamente facile differenziare il sarcoma dal linfoma o dal carcinoma ben differenziato, differenziare gli xenotrapianti di sarcoma dalle lesioni infiammatorie o dai sarcomi murini può essere difficile, poiché queste lesioni possono avere una morfologia molto simile.6

Quando si ha a che fare con casi difficili, o semplicemente per confermare che un tumore è davvero di origine umana prima di iniziare un esperimento, diversi metodi diversi progettati per rivelare proteine specie-specifiche o sequenze nucleotidiche, basati su immunoistochimica o ibridazione in situ, possono essere utilizzati per identificare cellule umane o murine. La caratterizzazione immunoistochimica delle proteine caratteristiche di un lignaggio cellulare è utile per specificare il tessuto di origine del tumore.

Particolare attenzione deve essere prestata al possibile sviluppo di linfomi umani nel sito di incisione di tumori non linfoidi, soprattutto durante l’impianto iniziale.11 Tali tumori portano i marcatori specifici delle cellule umane; questo può portare a confusione con un vero xenotrapianto se un esame morfologico della lesione non viene effettuato. Negli studi PDX, la maggior parte dei linfomi umani osservati sembrano svilupparsi da linfociti presenti nel campione di tessuto usato per l’incisione iniziale. Se queste cellule sono infettate dal virus di Epstein-Barr (EBV), i linfociti B possono subire una trasformazione per diventare cellule tumorali.17,18 Queste cellule sono eliminate efficacemente dal sistema immunitario negli esseri umani immunocompetenti, mentre il loro trapianto in topi immunocompromessi permette alle cellule B maligne di svilupparsi e di prendere il posto del tumore umano iniziale.11 Alcuni casi di linfomi umani periferici a cellule T EBV-negativi sono stati descritti anche nel contesto PDX.19 Se il tumore umano originale era chiaramente diverso dal linfoma (per esempio, un adenocarcinoma), allora lo sviluppo di un linfoma umano è facile da gestire, poiché un semplice esame morfologico è sufficiente a dimostrare che il tumore che cresce nel sito di incisione non è del tipo previsto e deve quindi essere scartato. Se il tumore originale era un “tumore blu”, allora la dimostrazione che il tumore trovato nel sito d’innesto è di origine umana può portare a un’interpretazione errata in assenza di ulteriori caratterizzazioni, perché questo tumore può essere in realtà un linfoma umano risultante dalla trasformazione maligna dei linfociti infettati da EBV presenti nel tumore iniziale, come discusso in precedenza.

Quando uno xenotrapianto è stabilito (i tumori PDX sono generalmente considerati stabilizzati dopo tre o cinque passaggi20), dovrebbe essere caratterizzato, sia in termini di tipo istologico che di differenziazione. Il tipo istologico del tumore è generalmente ben conservato negli xenotrapianti, quindi i carcinomi epidermoidi e gli adenocarcinomi tubulari, per esempio, hanno le stesse caratteristiche quando formano PDX.21 Si pensa che questa stabilità fenotipica sia legata alla stabilità biochimica, perché è improbabile che cambiamenti biochimici marcati portino alla conservazione delle caratteristiche morfologiche.6 La prima domanda che il patologo deve porsi, quindi, è se il tumore presente riproduce le caratteristiche morfologiche e biochimiche dei tessuti genitori.17 Se non lo fa, allora potrebbe corrispondere a un tumore murino, o potrebbe esserci stato un cambiamento importante nel modello di differenziazione del tumore, che richiederebbe ulteriori indagini.8

Tuttavia, in alcuni trapianti di prima generazione e sempre più dopo ulteriori passaggi, alcuni tumori possono tendere a diventare meno differenziati, con meno dotti o acini negli adenocarcinomi, e maggiori tassi di mitosi, pleomorfismo nucleare e atipia.20

Dettagli morfologici specifici possono cambiare durante i passaggi seriali, con l’acquisizione della secrezione di mucina o della differenziazione neuroendocrina, per esempio, che sono entrambi criteri per la progressione tumorale in alcuni carcinomi (per esempio, i tumori della prostata).22 Allo stesso modo, il modello di differenziazione tumorale può essere alterato da modifiche alle condizioni di incisione, con cambiamenti dello stato ormonale dell’ospite dovuti alla castrazione o all’integrazione ormonale, per esempio.22

Determinare se la morfologia del tumore è conservata dopo l’incisione, i passaggi seriali o gli esperimenti sono una delle difficoltà affrontate dai patologi. Infatti, xenotrapianti indipendenti dallo stesso tumore non sono mai strettamente identici, a causa della variabilità biologica e dell’eterogeneità intratumorale. Anche sezioni diverse dello stesso tumore e regioni diverse della stessa sezione possono mostrare differenze morfologiche. Le caratteristiche morfologiche delle cellule e dei loro nuclei, la loro disposizione spaziale, l’indice mitotico e la presenza di mitosi atipiche, il numero di corpi apoptotici e la frequenza di necrosi, l’abbondanza dello stroma e la vascolarizzazione differiscono tra sezioni e tra campi. Il patologo deve quindi determinare se il modello globale del tumore è conservato e, cosa più importante, se l’istologia del tumore xenotrapiantato corrisponde a quella del tumore originale del donatore. Le classificazioni internazionali dei tumori umani dovrebbero essere usate come base per un’accurata classificazione patologica degli xenotrapianti, ma è necessario un certo grado di flessibilità, perché gli xenotrapianti non riproducono mai perfettamente la morfologia del tumore umano originale.

Quando gli xenotrapianti sono seguiti in passaggi successivi o durante gli esperimenti, i cambiamenti qualitativi, come il passaggio da un modello trabecolare a uno tubolare, se riproducibili, possono essere considerati significativi, mentre i cambiamenti quantitativi, come le alterazioni dell’indice mitotico o la quantità di necrosi, soprattutto se sottili, devono essere interpretati con grande cautela.

Un’altra difficoltà nelle analisi istologiche di xenobanks tumorali deriva dalla natura parzialmente soggettiva dell’analisi morfologica. Se gli osservatori conoscono bene la morfologia di un certo tipo di tumore, allora la loro percezione è finemente sintonizzata per rilevare piccoli dettagli che possono diventare più evidenti con il tempo. La selezione di un campione di PDX stabilizzato da utilizzare come riferimento, per il confronto con i nuovi campioni, è consigliabile, per garantire che i vetrini siano letti nel modo più oggettivo possibile. Una banca digitale di vetrini virtuali può facilitare notevolmente questo compito. Se non è possibile rilevare alcuna differenza evidente tra il vetrino di prova e il riferimento, allora la lesione può essere considerata “simile”; ciò non significa che siano identici, ma solo che non si possono rilevare cambiamenti morfologici significativi.

Per il primo campione osservato in un esperimento di xenotrapianto, il riferimento dovrebbe essere un campione del tumore umano originale, o almeno avere una descrizione morfologica come il tumore in questione nel rapporto patologico del paziente. Se tale riferimento non è disponibile, il patologo può semplicemente dire che il tumore è “morfologicamente compatibile” con uno xenotrapianto di un tumore umano di una data categoria.