エリザベートは、1559年に神聖ローマ皇帝シャルル5世とポルトガル王イザベラの子であるスペイン王フィリップ2世と結婚した。 当初はフランスを離れる前にノートルダム寺院で代理人（アルバ公がフィリップの代理）により結婚していましたが、実際の式は到着後、スペインのグアダラハラで執り行われました。 この結婚は、カトー・カンブレシスの和約（1559年）の結果であった。 4038>
結婚式で画家のソフォニスバ・アンギソラ、そして生涯を共にすることになるアナ・デ・メンドーサと出会う。 フィリップ2世は、アンギソラを王妃の侍女兼宮廷画家に任命する。 アンギソラの指導のもと、エリザベートは素人画の技術を向上させました。 4038>
フィリップは14歳の花嫁にすっかり魅了され、1564年までには不倫をやめました。 エリザベートもまた、年齢差はあるものの、夫に満足していた（母に宛てた手紙では、これほど魅力的な王子と結婚できて幸運だったと述べている）。 フィリップは、妻をもてなすために騎士道的なトーナメントを開催して楽しんだ。 エリザベートは、スペイン宮廷の3人の若い王子の侍女役を務めました。 4038>
エリザベートは、もともとフィリップの息子であるアストゥリアス公カルロスと婚約していましたが、政治的な複雑さから、フィリップとの結婚が予想外に必要となりました。 問題を抱えた継子カルロスとの関係は、温かく友好的なものでした。 次第に奇行が目立つようになったが、カルロスはいつもエリザベートに親切に接し、優しくしてくれた。 4038>
フィリップはエリザベートを非常に愛し、天然痘にかかったときも彼女のそばで看病をしました。 1560年、エリザベートは最初の妊娠で息子を死産し、1564年には双子の女の子を流産しました。 その後、1566年8月12日にスペイン王女イザベラ・クララ・エウジェニアを、1567年10月10日にイザベラの妹キャサリン・ミシェルを出産した。 フィリップとエリザベートは二人の娘にジャムや人形、おもちゃなどを買ってあげるなど、とても仲が良かった。 イザベラの誕生を「二人とも息子の誕生のように喜んだ」と言われている。 エリザベートは1568年10月3日にも流産し、生まれたばかりの娘とともにその日に亡くなりました。
エリザベートの死後、キャサリン・ド・メディチはフィリップに自分の娘マーガレットを嫁がせることを提案しました。 フィリップはこの申し出を断りました。