化石軟組織構造
小さな組織パッチ（0.01-0.4 mm2; 図1a-dおよび補足図2-6）は化石羽毛と密接に結びついています（すなわち, 図1a-dおよび補足図2-6）。 この斑点はリン酸カルシウムで保存されているため（後述の「タフォノミー」参照）、試料調製時の現代物質による表面汚染を反映しておらず、化石組織であることが明確である。さらに、いくつかの試料では、周囲のマトリックスに部分的に重なる縁取りが見られる。
非鳥類のマニラプトラ恐竜と始祖鳥のリン酸塩軟部組織。 a-h Confuciusornis (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosaurus (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosaurus (IVPP V 12811; c, h) and Microraptor (IVPP V 17972A; d) の組織の後方散乱電子画像。 a-d 小さな不規則な形の組織パッチ。 e 多角形のテクスチャーを示す組織表面の詳細。 f 軟部組織の集束イオンビーム粉砕による垂直断面。内部の線維層が2つの無構造層を分離している。 g, h 軟部組織の破断斜視切断。f
で見えた層がわかる。組織パッチは通常3〜6μm厚で平面的（図1a〜e）であった。 横断面および破断面では，より薄い2つの無構造層（厚さ0.2-0.5 μm）の間に，内側の線維層（厚さ1.0-1.2 μm）が存在する（Fig. 1f-h）。 無構造層の外表面は滑らかで，幅10-15μmの多角形で定義される微妙な多角形テクスチャーを示すこともある（図1e，h）。
繊維層も多角形を示し（図1f，h，2a-e，補足図6），幅0.1-0.5μmの繊維が密に配列していることがわかる（図2f-i，補足図5f）。 保存状態のよい繊維はヘリコイド状にねじれている（図2h, i）。 各ポリゴンの辺縁部の繊維は幅0.1-0.3μmで組織表面と平行に配向し、各ポリゴン内部の繊維は幅0.3-0.5μmで通常組織表面と垂直である（図2b、hおよび補足図S6d）。 各ポリゴンの辺縁1-2μmでは、繊維は通常側面のポリゴン縁と直交し、隣接するポリゴンの接合部で終端するか、橋渡しをしている（図2f、g、補足図6e）。 ポリゴンは通常等寸法であるが、局所的に細長く、互いに整列しており、各ポリゴンの太い繊維は組織表面に亜平行で、細い繊維はポリゴン縁に平行である（図2j、k、補図6g-l）。 図2
Confuciusornis（IVPP V 13171）の軟組織の組織構造。 a, b 後方散乱電子顕微鏡写真；その他の画像はすべて二次電子顕微鏡写真。 a, b 密集した多角形。 c 繊維状の内容を示す多角形の詳細、d 解釈図。 e-g ポリゴン（e）と、ポリゴン間の接合部で橋渡し（f）および接する（g）トノフィブリルを示す表示領域の詳細。 h, i トノフィブリルのらせん状コイル。 j, k 伸縮変形を示すポリゴン
化石角質細胞
これらの化石組織の組織は、ホスト堆積物のコンコストラカン殻や魚鱗、現代のイシガイの殻、現代と化石の羽根裂片、現代の爬虫類表皮と異なる（補足図7a-n）。 いくつかのポリゴンは細長い形状をしており（図2j、k、補足図6g、l）、機械的ストレスによる非生体鉱物化組織の弾性変形を示唆する。 その大きさ、形状、内部構造から、この多角形構造はコルネオサイト（表皮のケラチノサイト）と解釈される。 現代の羊膜類では、これはケラチン トノフィブリル、脂質、マトリックスタンパク質で満たされた多面体扁平細胞（1〜3μm×約15μm）である18,19,20（図3a、b、補足図2u〜x、8,9）。 これは、リン酸カルシウムによる斜方成長（「タフォノミー」参照）を反映しており、予想外のことではなかった。 化石の角質細胞の繊維は、鉱化したトノフィブリルとして同定された。これは、幅 0.25-1 µm のスーパーコイル状のα-ケラチン繊維のまっすぐで枝分かれしない束で、角質細胞の細胞骨格22の主成分で、無定形の細胞骨格タンパク質22に包まれている。 化石では、薄いトノフィブリルはしばしば隣接する細胞のものと接しているが（図2g、補足図6e）、局所的には隣接する細胞間の境界を橋渡ししていることもある（図2f）。 後者は、現代の角層細胞間に存在する強い細胞間接着領域であるデスモソームを想起させる23。 化石角質細胞内の中央の球状構造は、現生鳥類（現生爬虫類や哺乳類は除く）の角質細胞24と同様に、死細胞核24に類似している（補足図8）。 現存する鳥類24では、この死細胞核の位置は角化細胞表面の窪みで示されることが多く（図3b）、化石細胞にも同様の窪みを示すものがある（図2cおよび補足図6a〜c）。
現存する鳥類の角膜細胞。 a-d 現存するシマエナガチョウ (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d) の剥皮の走査型電子顕微鏡写真。 a 角質細胞が多角形のテクスチャーを形成している。 b 中央のくぼみ（矢印）は錐体細胞核の位置を示す。 c, d 羽毛に巻き込まれた脱皮片
Taphonomy
ケラチンは重架橋した準結晶構造と疎水性非極性により比較的軟弱な生体分子とされている23。 このプロセスは通常、初期の腐敗に特徴的な急峻な地球化学的勾配を必要とし25、筋肉26や消化器組織27などの腐敗しやすい組織に適用されるため、化石角質細胞のリン酸カルシウムへの複製はやや予想外であった。 しかし、真皮のコラーゲンなど、腐敗しにくい組織は、固有のカルシウム源、特に腐敗中に放出されるリン酸イオンを含むリン酸カルシウム中に複製することができる28。 角層細胞は、これら両方のイオンの供給源を含んでいる。 末端分化の間、細胞内のカルシウム濃度は増加し29、α-ケラチン鎖は広範囲にリン酸化される23。 さらに、角層細胞脂質顆粒30は、リンとリン酸に富んでいる31。
現存する哺乳類では、トノフィブリルの密に詰まった配列は、安定性のために豊富なインターケラチンマトリックスタンパク質を必要とする32。 しかし、これらのタンパク質は化石には見あたらない。 現存する鳥類の角化細胞では、このタンパク質は稀であり33、しかも、分散した単量体34として存在し、高度に架橋・重合したケラチン束であるトノフィブリルよりも保存性が低いと考えられるため、これは意外ではない。 化石角質細胞の無構造外層は、生物学的テンプレートと考えられるもの、すなわち角質細胞包（末端分化の際に細胞膜に取って代わる、厚さ100nmまでの脂質、ケラチンおよび他のタンパク質の層34）および／または細胞膜より厚い。 これは、リン酸カルシウムの沈殿を助長する局所的な微小環境を反映していると考えられる。終末分化の間、カルシウムイオン36に高い親和性を持つ、広範囲にリン酸化されたタンパク質35であるケラトヒアリンの顆粒が、発達中の角質細胞の周辺に蓄積される37。 化石中のリン酸カルシウムの外側の固形層の厚さと、そこから徐々に内側の繊維層に移行することから、リン酸塩の沈殿は、縁から角質細胞の内側に向かって進行したと考えられる。 このシナリオでは、細胞の辺縁部で利用可能なリン酸は、トノフィブリルを複製するのに必要な量を超えていたはずである。
羽毛恐竜と初期鳥類の皮膚剥離
現生無脊椎動物では、表皮角化層は通常5〜20細胞の厚さ（ただし厚さは種や体内の位置によって異なる38）。 しかし，化石の角化層のパッチは1細胞の厚さである（図1fおよび補足図5c, 10）。 これに加えて、パッチのサイズが一貫して小さいこと（<400μm）、保存の忠実度が著しく高いことから、連続したシートの原位置組織が選択的に保存されたのとは矛盾している。 少数例（n = 8）では、皮膚は化石軟部組織のサンプルの端にあり、したがって、もともと大きな化石皮膚の断片（残りの断片は化石スラブ上にある）の小さな断片を表す可能性があります。 しかし、ほとんどの例では、皮膚片の輪郭全体が試料の余白に収まっている。 様々な試料の縁を高倍率で調べると、試料と周囲の堆積物が全く同じ平面上にあることが多い（例えば、補図10）。 皮膚サンプルの縁が堆積物に覆われている場合でも、化石皮膚はほぼ完全な平面であるため、自然な分割面を形成し、サンプルは見かけ上の大きさよりもはるかに大きかったと考えられる
皮膚の保存厚が準備や侵食による人工物であるという証拠は何もない。 岩板を割るとき、割断面はしばしば軟組織を不均一に通過し、異なる深さの構造を露出させる。 今回の化石では、割断面は通常、角質層を通過し（内部構造が露出し）、まれに角質層外面に沿って通過する。 2層以上の角層が除去されたことを示す証拠はない。 FIB切片は1層のみの保存を示し、いくつかのSEM画像は保存された皮膚を通る完全な垂直断面（上下の堆積物との関係が見える）を示し、角質細胞は1層のみであることを示す証拠である。 化石スラブの分割面が組織のパッチを通過するところでは、化石角質細胞の繊維状の内部充填物が露出している。 しかし、化石の角質細胞の地形は、分割面の位置によって変化し、軟組織を通してミリメートル単位で局所的に変化することがある。角質細胞は、縁が盛り上がり、中央に窪みがあるものや、縁が窪んで中央に隆起した部分があるもの（図S9）である。
角質細胞の斑のサイズ、不規則な形状、厚さは、角質層の剥離片（ふけ状の粒子39；図3）に似ている。 現存する鳥類では、角化細胞は個々に、あるいは羽毛の中に巻き込まれるように最大0.5mm2のパッチで排出される（図3c、d、補足図2u、v）。 本書で紹介した化石は、始祖鳥と非鳥類型マニラプトラ類における皮膚脱落の最初の証拠となり、少なくともいくつかの非鳥類型恐竜が小さなパッチで皮膚を脱落させたことを確認した40。 この脱皮様式は現代の鳥類18（図3c,d）や哺乳類20と同じであり、継続的な体細胞成長を意味する。 このことは、現存する多くの爬虫類（例． 9019>
Evolutionary implications of fossil corneocyte structure
化石角化細胞は、現生鳥類や哺乳類の対応するものに見られる主要な適応を示し、特にその扁平多角形の形状やαケラチントノフィブリルに一致する繊維状の細胞内容を持っていた16。 さらに、化石トノフィブリルは（現存する例と同様に22）強固な細胞間結合を示し、角質細胞シート全体に連続した足場を形成している（図2b、c、jおよび補足図6）。 一方、現存する爬虫類の角膜細胞は、β-ケラチンの均質な塊（細胞外皮にはさらにタンパク質が存在する）を含み、発生過程で融合し、明確な細胞境界のない成熟β-層を形成する42。 化石角質細胞における錐体核の保持は、現代の爬虫類には見られない鳥類特有の特徴である（ただし文献20参照）。
表皮の形態形成と分化は、アラプシッドとサウロプシッドで分岐したと考えられている31。 我々のデータは，鳥類と哺乳類で共有される表皮の特徴が収斂進化を示すという他の証拠を支持し43，脂質に富む角質の内容が鳥類や羽毛のある非鳥類マニラプトランで進化的に派生した特徴である可能性を示唆する． Evo-Devo研究により、鳥類の表皮は「原始羽毛」を持つ鱗状皮膚のヒンジ領域の拡大から発生した可能性が示唆されている20。 しかし、私たちの研究から、鳥類や恐竜の表皮は、動力飛行ができない種であっても、すでに明らかに現代的な進化を遂げていることが明らかになった。 このことは、ここで述べた表皮の特徴の少なくともいくつかは、より基層の獣脚類に由来する可能性を排除するものではなく、特に保存された皮膚に鱗の証拠がない場合（Sciurumimusのように44）、その可能性は大きい。 表皮におけるケラチンの複雑な発現45、ケラチノサイトの終末分化、羽毛動物の皮膚におけるα-とβ-ケラチン合成の分配32を調節する洗練されたゲノムメカニズムは、おそらく中期ジュラ紀後期までにマニラプトラの基部に近いところで羽毛進化と同時に変更された（図4）。 既存の化石データによると、これはマニラプトラ類のくちばしの進化後、前肢の膝状突起と翼状突起の進化前に起こったと考えられる（図4）。これらの特徴の最初の化石出現は約10-15 Maであり、下部-中部ジュラ紀の境界近くで、羽毛外装の進化における革新が起こったことを示唆している。 羽毛に関連する真皮筋組織を示す最古の証拠は、約30 Ma若い、125 Maの鳥類である17。 羽毛の支持と羽毛の向きの制御においてこの真皮ネットワークが果たす重要な役割を考えると18、羽毛を持つ非鳥類マニラプトランにおけるその不在は、タフォノミーのバイアスを反映しているのかもしれない。 系統図は，最小分岐長（mbl）と全レート差（ARD）として起こる遷移に基づく最尤モデルの中で最も可能性が高いものである。 鉤爪と足蹠はコエルロサウルスでは原始的なものと考えられている。 ケラチノサイトの変化と連続的な脱落は、Maniraptoraの基部付近で発生したことを示すデータが得られている。 このことは、将来の化石発見に基づいて、他の羽毛分類群を含むコエルロサウルス類の基部に向かってシフトすることが予測される
ある面では、化石の角化細胞は明らかに非鳥類のもので、羽毛恐竜や初期の鳥類が現代の鳥と非羽毛恐竜の間で移行する独特の関節の構造と生理を持つことが示された。 現生鳥類では、角膜細胞のトノフィブリルは細胞内脂質の中に緩く分散しており19、飛行中の熱生産に対応した蒸発冷却や羽毛による断熱を容易にしている46。 一方、化石のトノフィブリルは密に詰まっており、細胞内部を満たしている。 化石角質細胞が死後に収縮した証拠はない。サイズ範囲は現代の鳥類のものと一致しており、斜行によるしわや歪み、個々の細胞の分離の証拠もない。 このことは、化石角膜細胞のトーンフィラメントの密度は、現生鳥類よりも元々高い密度を反映していることを強く示唆している。 これは体の大きさの関数ではない。現存する大きさの異なる鳥類（例えば、ゼブラフィンチとダチョウ）は、緩く分散したトノフィブリルを示す47。 したがって、化石の鳥類は蒸発冷却に対する生理的要求が低く、ひいては飛行活動に関連する体熱生産が現代の鳥類よりも低かった可能性が高い46。 このことは、非鳥類のマニラプトラ類47,48や底生鳥類47の基礎代謝率が低いという他の証拠や、ミクロラプトル49や潜在的にはコンフィオソルニス48（ただし文献50参照）の羽毛が、少なくとも長期間にわたる動力飛行に適応していなかったという仮説と一致している50.
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