溶液構造。 Anopheles C型レクチンCTL4とCTLMA2の糖鎖特異性とフェノール酸化酵素阻害活性

Conservation of CTL4/CTLMA2 in Anopheles

CTL4 とCTLMA2はともにシグナルペプチド、CXCXCモチーフを含む短いN末配列、単一のCTLドメインから構成され、CTLドメインはCTL4とCTLMA2との間にある。 最近の報告では，Anopheles内でCTL4とCTLMA2あるいはその補因子の機能が分岐しており，特にAn. albimanusのCTL4はジスルフィド結合に関わるN末端のシステイン残基を含んでいないと示唆されている22． まず、2L染色体上で背中合わせに近い向きを持つCTL4（AGAP005335）とCTLMA2（AGAP005334）のオルソログを、Vectorbase24の現行遺伝子モデル（2019年2月現在）を用いて再検討した。 An. albimanus AALB014534を含む15/16のCTL4オルソログと13/14のCTLMA2オルソログについてN末端にCXCXCモチーフを持つタンパク質を見出した。 我々は、アジア、アフリカ、新世界の10種のAnophelesから得たCTL4とCTLMA2の両方の多重配列アラインメントを実施した（図1b）。 根のない系統樹はほぼ同じトポロジーを持ち、組み合わせた系統樹は、An. funestusとAn. maculatusに対するAn. dirusの位置を除いて、対称な2本の枝を持っている。

An. gambiae CTL4/CTLMA2はN-末端CXCXCモチーフのシステイン間の分子間ジスルフィドにより安定化されていることが示されている；これらの3つのシステインをアラニンに変異させると鎖間ジスルフィドの形成が阻害された20。 鎖間ジスルフィドの位置をさらに詳しく調べるために、CTL4とCTLMA2のN末端CXCXCモチーフに1つのシステインを含む9つの変異体を作り、Sf9細胞で共発現させて、ウェスタンブロッティングでCTL4とCTLMA2の検出を行なった。 分子間ジスルフィド形成は非効率的であったが、すべてのケースで非還元SDS-PAGEで明らかであった（図2c）。

これは、CTL4とCTLMA2間のN末端分子間ジスルフィド形成が、それぞれのタンパク質から特定のシステイン残基に関与するというより、プロミスキュアであることを示唆している。 もし分子間ジスルフィド形成がプロミスキャスであれば、CTL4/CTLMA2ヘテロダイマーは原理的に多価のジスルフィド架橋オリゴマーを形成する可能性がある。 しかし、An. gambiae CTL4/CTLMA2のNR-SDS-PAGEでは、ジスルフィド結合したオリゴマーは検出されなかった（図2a）。 同様に、CTL4とCTLMA2はin vitroでジスルフィド結合したホモダイマーを形成できるが20、精製品は圧倒的に(>95%)ヘテロダイマーである。 An. albimanus CTL4/CTLMA2 の NR-SDS-PAGE では、ホモダイマーまたはオリゴマー形成を示すと思われるいくつかのマイナーバンド (~10%) が観察される (Fig. S1b)

An. gambiae CTL4/CTLMA2 と An. albimanus CTL4/CTLMA2 は、どちらも溶液中で多分散であった。 高次の非共有結合性オリゴマー化は，SECにおいて濃度の増加とともにメインピークの肩として現れ，An. albimanus CTL4/CTLMA2においてより顕著に見られた（図S1）． 我々は、沈降速度分析超遠心法（AUC）によりオリゴマー種の存在を確認した（Fig.2d）。 pH7.5では、c(s)分布において、s1 = 3.1 s、s2 = 4.4 s、s3 = 5.9 sと強度が減少する一連の種が観察された。オリゴマー化はA. gambiae CTL4/CTLMA2ではCa2+に依存しなかったが、A. albimanus CTL4/CTLMA2 では Ca2+ に依存せず (Fig. S1b) 、動的光散乱 (DLS) による pH とは相関がない (Fig. 2e). しかし，CTL4はCa2+結合残基が変異しており，CTLDであってもC型CRDではない可能性が示唆された。 そこで、An. gambiaeのCTL4、CTLMA2、An. gambiaeとAn. albimanusのCTL4/CTLMA2 heterodimerのカルシウム結合親和性を等温滴定カロリー法（ITC）により測定した。 同等の条件下で、CTLMA2とCTL4/CTLMA2に結合が確認されたが、CTL4には結合しなかった（図3a-c）。 結合定数と熱力学パラメータは、3つの独立した実験の結果から算出した（表1）。 CTLMA2のCa2+結合は、KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/molの単一部位モデルによってよく適合された。 An. gambiaeのCTL4/CTLMA2のカルシウムに対する親和力はCTLMA2よりも40倍ほど高く、KD = 4.9 ± 0.5 μM, Δ23 ± 4 kcal/molであった。 An. albimanus CTL4/CTLMA2 (図3d) は、KD = 2.82 μM, ΔH = -12.1 kcal/mol で、カルシウムに対して同様の親和性を持っている。 しかし、An. gambiaeとAn. albimanusの両方のCTL4/CTLMA2へのカルシウムの結合はサブストイキオメトリック（N = 0.36-0.50）だった。

それらのレクチン活性を定義するために、CTL4、CTLMA2およびCTL4/CTLMA2 heterodimerを、367個の固有の糖鎖構造を示す糖鎖アレイ上で解析した28。 これらの研究により、様々な糖鎖に結合することが示された（表2）。 CTL4とCTLMA2の単量体は、それぞれ4つと6つの糖鎖にしか結合しないが、ヘテロ二量体は18の異なる糖鎖に結合することが示された。 CTL4が認識する糖鎖の3/4（75％）、CTLMA2が認識する糖鎖の2/6（33％）はCTL4/CTLMA2には認識されないというように、個々のモノマーとヘテロダイマーが結合するリガンドには大きな違いがある。

Glycan array resultsの確認とCTLの結合優先度を決定するために、SPR分析を行った（Table3）。 ほぼすべての相互作用において、グリカンアレイとSPRは相互作用の存在について一致し、SPRはグリカンアレイに4つの偽陰性があることを示しました。 CTLMA2モノマーとH-抗原、コンドロイチン硫酸およびコンドロイチン-6-硫酸、そしてCTL4モノマーとコンドロイチン-6-硫酸の4つである。

CTLは、CTLMA2に存在するカノニカルEPNモチーフにもかかわらず、CTL4/CTLMA2によるマンノース6-リン酸を除いて、マンノースを含む糖鎖を認識しなかった。 むしろ、認識される構造は一般にグルコース（Glc）、ガラクトース（Gal）およびそれぞれのヘキソサミンGlcNacとGalNac間のβ1-3/β1-4結合からなるグリコサミノグリカン（GAG）モチーフである。 Galβ1-4Glc結合は12/23 (52%) の糖鎖に存在し、Galβ1-4GlcNacを含む6/23 (26%) とケラタンモチーフGalβ1-4GlcNac β1-3Gal または GlcNac β1-3Galβ1-4Glc を含む4/23 (17%) が認識される。

またこの配列では重合糖と硫酸化糖を好む傾向があることがわかった。 CTL4が認識した4つの糖鎖のうち、最も強くヒットしたのはグロボペンタオース（Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc）; CTL4はHA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n とβ1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n にも結合している。 CTLMA2単量体が認識する5つの糖鎖のうち3つは硫酸化されており、CTL4/CTLMA2 heterodimerはコンドロイチン硫酸とコンドロイチン6硫酸、ヒアルロン酸 (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 、および HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n を認識していた。 これらの結果は、糖鎖結合におけるヘテロ二量体化の異なる効果と相乗効果があることを示唆している。

CTLMA2とCTL4/CTLMA2ヘテロ二量体はともにシアリルLewisXとスルホLewisAを含むいくつかのフコース含有糖鎖を認識するがシアリルLewisAは認識していない。 最も高い親和性を示したのはスルホ-LewisAで、CTLMA2 (106 nM) とCTL4/CTLMA2 (95 nM) 複合体のKDは〜100 nMだった (Table 3)。 6749>

構造解析

CTL4とCTLMA2の構造をさらに調べるために、MODELLER29を用いてCTL4とCTLMA2の構造モデル（図4b）を作成し、手動でさらに編集を加えた。 CTL4とCTLMA2は共に、CTLDの第2ヘリックスに続く拡張ループ（ループ1）を持ち（図4a）、相補的な電荷を持つ残基（CTL4は塩基性残基、CTLMA2は酸性残基）が高い密度で存在しています。 これらのループ1残基の相補的な静電特性とN末端のCXCXCモチーフへの近接性から、これはヘテロダイマー内のタンパク質/タンパク質界面である可能性が示唆され（図4b）、CXCXCモチーフに単一のジスルフィド結合を持つ仮説的モデルが作成されている。 しかし、D. acutus X-bpの2本の鎖で観察されたように、糖鎖/Ca2+結合ループは第2の潜在的な界面である。 代替仮説は、2つのCTLドメインは互いに独立しており、柔軟なリンカーが分子間仮説を介してそれらを結合しているというものである。

この仮説を検証するために、我々はCTL4/CTLMA2の溶液構造を小角X線散乱（SAXS）で解析した。 実験は0.5 M NaCl，20 mM CHES pH 9.0，0.5 mM CaCl2，1%グリセロールで行い，粒子間相互作用を最小にした。 これらの条件下で、タンパク質は3.1 mg/mlの濃度まで、零角での外挿強度と濃度との間に直線関係（I0 vs. c）を示した。 強度I vs. qの緩衝液で減算した曲線（図4c）をSAXSMoW2にかけると、RG = 23.0 Å (I0 = 0.61) と分子量MW = 39 kDaが得られ、予想されるヘテロダイマーのMW 35 kDa30より11%だけ大きくなった。 しかし、計算されたGuinierプロットはわずか7点のデータに基づいており、拡大した範囲でのフィッティング（図4c、挿入図）によりRG = 24.5 Å（I0 = 0.64）が得られ、ペアワイズ分布関数P（r）のフィッティング（図4d）によりRG = 25.4 Å（I0 = 0.65）が得られました。 DAMMIF31で20個の第一原理ビーズモデルを用いてP(r)分布をフィットしたところ、平均正規化構造不一致NSD = 1.0 ± 0.2であった。 CXCXCモチーフを含む両タンパク質のN末端配列、または高い回転半径を持つCTL4/CTLMA2の少数集団を反映できるビーズモデルの主体から、追加の密度が広がっています。 この仮説を検証するために、我々はプログラムMULTIFOXS32を用いてSAXSプロファイルのマルチステートモデリングを行った。 CTL4 C39とCTLMA2 C34の間の分子間ジスルフィドで終端したN末端コイルドコイルを持つCTL4-6xHis/CTLMA2の完全なモデルを作成しました。 MULTIFOXSは、実験的散乱曲線と比較するために、このモデルの10,000のバリアントのアンサンブルを生成しました。 柔軟な残基はCTL4 40-45と178-183（6xHis）、CTLMA2 35-39のみで、N末端のコイルドコイルが2つの鎖をつなぐ剛体として機能していました。 最良の1状態モデルは、χ2 = 1.13, RG = 23.7 Åでデータに適合した。最小のχ2 = 1.07 は、3状態モデルで達成され（図4e）、散乱の80%は、RG = 22.0 ÅとRG = 23.7 Åの二つのコンパクトモデルによって寄与されている。 このデータは、CTL4とCTLMA2のコンパクトなヘテロダイマーの形成と一致する。

CTL4/CTLMA2 は大腸菌

に応答してフェノール酸化酵素の活性化を阻害するCTL4とCTLMA2は、感染に対する蚊の黒化応答の阻害剤として機能する。 以前、大腸菌と黄色ブドウ球菌の混合菌の感染に対して、CTL4ノックダウンではフェノールオキシダーゼ（PO）活性が上昇しないことが報告された20。 しかし、同じ研究では、dsCTL4 と dsCTLMA2 の蚊は、グラム陰性菌に特異的に感受性があることがわかった。 そこで、CTL4 と CTLMA2 のノックダウンが、大腸菌感染のみに対する血球PO活性に及ぼす影響を再度検討した（図5a）。 大腸菌感染後4時間で、dsCTL4 (p = 0.02) とdsCTLMA2 (p = 0.004) の蚊は、dsLacZ対照と比較してPO活性が著しく向上した (Fig. 5b)。 CTL4およびCTLMA2の平均ノックダウン効率は、それぞれ93±3％および89±3％であり、任意の1回の実験において>80％であった。