軸索形成遺伝子における希少な変異が音色共感覚を持つ3家系をつなぐ

結果

我々はWESを用いて、音色共感覚を持つ3家系の多世代にわたるゲノムコード部分における遺伝子変異を特定した（図1参照）。 それぞれの家族について、3世代にわたる4～5人の検証済み共感覚者と、少なくとも1人の非共感者の家族からエクソーム配列を入手した。 本研究のすべての症例は、確立された真正性のテスト（SI Materials and Methods）を用いて確認された音色彩感覚を有していたが、一部の症例はさらに一般的なタイプの共感覚（例えば、平日の色彩感覚）を経験している可能性がある。 この家族はCambridge Synesthesia Research Groupのデータベースから特定され、もともとマイクロサテライトマーカーを用いて、聴覚-視覚共感覚の形態を持つさまざまな大きさの43家族にわたる遺伝的連関の証拠を探す2009年の研究に含まれていた(20)。 本研究の家族は、サイズ、構造、および適切なDNAサンプルの入手可能性に基づいて、WESによる研究に最も適した家族として選択された。

Cambridge Synaesthesia Research Groupの3つの多重家系における音色共感覚。 (A)家系の血統。 丸印は女性，四角印は男性を示し，灰色の網掛けは共感覚を示す。 青線はどの家系がWESを受けたかを示している。 (B)3人の仮想的な人物に2つの聴覚刺激を与え、3回の試行（色のついたボックス）で音と色のマッチングを行った図。 共感覚者（左の箱）は試行間で高い一貫性を示すが、非共感者（右の箱）は色の選択に一貫性がない。

ノンパラメトリック連鎖解析を用い、遺伝的異質性を仮定したところ、2009年の研究の著者は連鎖を示唆する3領域（5q33、6p12、12p12）を発見した（23）。 2q24の染色体は、遺伝子削除シミュレーションの結果、有意な連鎖を示した（異質性オッズスコアの対数、HLOD 3.02、P値0.047）(20)。 また、配列-色彩感覚（数字や月などの配列に対する色の連想）を持つ他の5家族についての独立した調査では、染色体16qに遺伝子座があることを示唆する証拠が報告されたが、これは5家族のうち2家族でのみ支持された(19)。

ゲノム解析ツールキットのDNAバリアントを呼ぶためのベストプラクティスガイドラインに従い、低品質のバリアントや配列深度が低いもの（家族2：8,195、家族11：9,202、家族16：8,074）（24）を除去後、音色3家族全体で11,597個のバリアントを同定した。 原因となりうるバリアントを上昇させるため、共感覚の遺伝的構造に関する限られた知識と音色の多様性（家族性または散発性）の有病率に基づくろ過基準を適用した。 2006年の研究では、英国人口の最大4.4％が少なくとも1つの形態の共感覚を経験する可能性があることを立証したが、音色の共感覚の有病率はよく研究されていない（7、23、25）。 推定値は、イギリスの500人に1人の非選択者（同じ有病率調査から）から、自己紹介したオランダとドイツの共感覚者の41％までの範囲である（7, 25）。 これらの推定値の不確実性を考慮し、潜在的に関心のあるバリアントを強調するために、比較的包括的な最大マイナーアレル頻度（MAF）0.01を選択した。 合計すると、家族全体で3,864のバリアントがあり、さらに検討するのに十分な希少性があった（家族2: 1,812; 家族11: 2,727; 家族16: 1,862; 後述のさらなるフィルタリングの前に、家族間で部分的に重複するバリアントを含むことに注意）

3 家族の血統構造に基づいて、我々は、完全浸透率の支配遺伝に従うバリアントを保持した（図1A）。 先行する遺伝子スクリーニングの知見から、家族性音色彩感覚は特定の家族内の単一バリアントによるものかもしれないが、そのようなバリアントは異なる家族間で共有されているとは考えにくいと仮定した(20)。 これを検証するために、私たちは、保持された変異体の中から、別々の家系内で共感覚と完全に分離する希少なヘテロ接合型変異を探しました。 その結果、37の遺伝子に合計37のバリアントが見つかった（表1）。 すべての家系のすべての共感覚者に共通する変異体はなく、遺伝的不均質性の仮説と一致した。 RGS21のミスセンス変異は16家系のすべての共感覚者に検出されたが、2家系の1人の共感覚者にしか見つからなかった。 さらに共感覚の遺伝的異質性を裏付けるものとして、3家系すべてで完全に分離する変異を含む単一遺伝子はなかった。 ハイライトされた37のバリアントは、先行研究（19、20）で報告された示唆的な連鎖のピークには該当しなかった。

3家系に共通するメカニズムをさらに明確にするために、WESから得た推定候補遺伝子のセット内に濃縮した遺伝子オントロジー用語があるか否かを評価した。 電子的なアノテーションは、手動でキュレーションしたものよりも情報量が少ないと考えられるため、推論されたものは除外した。 オントロジー解析の結果、主に神経発生に関連する狭い範囲の用語が有意に濃縮されていることが確認された（表2）。 特に、6つの遺伝子は軸索形成（GO:0007409）および細胞移動（GO:0016477）と関連しており、共感覚の超接続性の説明と明らかに関連性のある生物学的カテゴリであった。 これらの遺伝子、SLIT2、MYO10、ROBO3、ITGA2、COL4A1、SLC9A6（表1ではアスタリスクでマーク）は、3つのファミリーにまたがり、より高いレベルで調査できる特定のプロセス（例えば、,

Have identified variants in the core set of six candidate genes with potential functional relevance for neurobiological accounts of synesthesia etiology, we went on to study their expression in neural tissues.「共感覚の病因に関連する、機能的関連性を持つ6つの候補遺伝子のコアセットにおける変異を特定した後、我々は、神経組織におけるそれらの発現を調査してきた。 RNA-sequencing（RNAseq）に基づくGenotype-Tissue Expression Project（GTEx）とマイクロアレイに基づくAllen Human Brain Atlas（ABA）という二つの補完的データセットを用いて、候補遺伝子の発現パターンを調べた（26，27）。 GTExには、前頭葉皮質を含む13部位からRNAを採取した>100人の死後ヒト脳のデータが含まれている(26)。 タンパク質の発現量はRNAの発現量と必ずしも一致しないため（28）、これらの知見をHuman Protein Atlasの免疫組織化学データ（成人ドナー脳3人（年齢37-70歳）のヒト大脳皮質組織から手動で定量したタンパク質発現を含む）と組み合わせた（29）。 このアトラスには、ROBO3を除く各タンパク質の結果が含まれている。 残りの5つのタンパク質は、程度の差はあるものの、すべて神経細胞で観察された（表S1には、複数の抗体で異なる結果が得られた場合の範囲を示した）。 神経細胞以外では、複数の候補が神経膜と内皮細胞に染色性を示し、SLIT2だけがグリアに高いレベルで観察された。 これらの結果はGTExのRNAseqデータを支持し、6つの遺伝子が成人の脳組織で活性であることを示している。

GTExとHuman Protein Atlasリソースは共感覚研究に関連するいくつかの皮質領域のデータを欠いており、組織は主に中年の成人から収集されたものである。 そこで次に、ハイライトされた遺伝子が聴覚皮質、視覚皮質、頭頂皮質で活性を持つかどうか、また発生過程での発現パターンを調べたところ、聴覚皮質、視覚皮質、頭頂皮質で活性を持つことが判明した。 共感覚を媒介する神経解剖学的領域や活動パターンについては、視覚野の役割を支持する報告や、頭頂葉の感覚統合を強調する報告など様々である(11, 14, 30)。 我々は、死後脳6個から約500カ所サンプリングしたマイクロアレイデータを、構造MRIスキャン（ABA）にマッピングし、より詳細な方法で遺伝子発現を可視化した（27）。 方法論は異なるものの、GTEx皮質サンプルの発現値は、ABAの前頭葉皮質データとよく相関していた（Pearson, r = 0.95, P = 0.004）。 ABAでは、6つの遺伝子のそれぞれが、聴覚、視覚、頭頂皮質を含む脳全体に広く発現していることがわかった（図2A）

縦断的研究により、共感覚の関連は小学校時代にしばしば形成され、軸索形成は主に胎児期の発生から人生の最初の数年間に起こることが示されており、ヒト脳の発生全体にわたる候補遺伝子の発現を調べることを促した(15)。 このプロジェクトは、受胎後8週齢から40歳までのヒト脳組織を含み、各時点で1〜3個の脳から平均13領域（範囲：1〜17）をサンプリングし、RNAseqを用いて測定したものである(31)。 その結果、胎児期から幼児期にかけて、聴覚皮質、視覚皮質、頭頂皮質で発現が検出された（図2B）。 最後に、6つの候補遺伝子が特定の神経細胞タイプで優先的に発現しているかどうかを調べるため、マウス大脳皮質から分離した6つの細胞タイプのRNAseqデータセットを用い、高い細胞タイプ特異性を確保するために一連の抗体ベースの精製ステップを行いました(32)。 候補遺伝子は、神経およびグリアのトランスクリプトーム全体で広く発現しており、ミクログリアでの発現レベルは比較的低かった（図2C）。

これまでの共感覚遺伝学研究では、ファミリーサイズが小さいという制限に直面するだけでなく、今回採用した方法よりも精度の低い方法の使用によって制限されていた。 そのため、本研究の結果がこれらの先行報告と関連する可能性があるかどうかを検討した。 共発現パターンは、類似の神経発達過程に関与する遺伝子を明らかにすることができる。そこで、先行研究の証拠のほとんどが示唆的なレベルであることを認めつつ、6つの候補と共発現している遺伝子が先行研究の推定連関ピークに含まれるかどうかを検証した(33)。 Asherら(20)が報告したピークは、本研究で用いた3つの家系内では連鎖の結果とは考えにくく、その領域内では分離する変異が見つからなかったからである（表1）。 したがって、5q33、6p12、12p12、2q24（音-色彩感覚）および16q12.2-23.1（配列-色彩感覚）からのピークは、他の家族からのシグナルを表していると考えられる。 これら6つの候補を種遺伝子として、神経の発生過程でr > 0.7で共発現している遺伝子を109個見出した(31)。 共発現遺伝子の完全なセットは、以前に報告された共感覚の連鎖のピークに位置する6つを含んでいた。 しかし、濃縮の正式な検定では統計的な有意性は得られなかった（フィッシャーの正確な検定、オッズ比=2.069、P=0.08）。 この拡張セット内でReactomeから既知のタンパク質-タンパク質相互作用をマッピングすると、比較的疎なネットワークが得られたが、サブネットワーク内のハブとしてITGA2とCOL4A1が含まれていた（図S3）＜6416＞＜4751＞最後に、最近の知見は、自閉症スペクトラム状態（以下、自閉症）とサヴァン能力を持つ人々が共感覚を経験する傾向があること、そしてグループとしての共感覚者は自閉症に見られるのと同様の非定型の感覚過敏を見せることを示していた（34、35）。 そこで我々は、自閉症のない共感覚者から発見された遺伝子変異が、自閉症に関与する遺伝子経路と関連する可能性があると仮定した。 この研究のために家族を募集する際、神経疾患（自閉症を含む）の併存が除外基準となっていた（20）。 我々の家族で共感覚の状態を追跡した37の変異体のうち3つは、自閉症関連遺伝子のSimons Foundation AutDBカタログで見つかった遺伝子内にある。 FGA（ファミリー16）、HYDIN（ファミリー2）、SLC9A6（ファミリー11）(36)である。 しかし、共感覚を持つ家族に見られる特定の遺伝子変異（表1）は、現在AutDBに含まれている自閉症症例と共有されていない。 また、この3つの遺伝子は有意な濃縮を示さなかった（フィッシャーの正確検定、オッズ比＝2.01、P値＝0.20）。したがって、自閉症に関連する遺伝子の数が多いことから、これらの変異が存在することは珍しいことではないのである。 109個の共発現遺伝子のうち4個は以前に自閉症と関連していたが（図S3）、これもまた有意な濃縮を表さない（フィッシャーの正確検定、オッズ比＝2.084、P＝0.13）

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