Alternative Splicing（代替スプライシング）。 真核生物ゲノムにおける機能革新の可能性

Abstract

Alternative splicing（AS）は真核生物に共通する転写後のプロセスであり、1つの遺伝子から複数の異なる機能転写産物が生成される。 ヒトゲノムドラフトの公開により、予想よりもはるかに少ない数の遺伝子が明らかになった。 タンパク質の多様性を拡大する役割を担う可能性があることから、この10年間、代替スプライシングへの関心が高まっている。 最近の研究により、ヒトのマルチエクソン遺伝子の94％がASを受けることが明らかになったが、真核生物ゲノムの機能革新におけるASの進化とその潜在的役割は、ほとんど未解明であった。 ここでは、ASの有病率と機能的役割の進化に関する利用可能な証拠についてレビューする。 さらに、ASの検出における転写範囲の強い影響を補正する必要性を強調し、ゲノム規模での機能革新におけるASの役割の程度を最終的に解明する戦略を打ち出した

1. はじめに

2001年2月にヒトゲノム配列の最初のドラフトが公開され、驚くべきことに、それは当初予測された遺伝子数のほんの一部である、〜23000遺伝子を含むことが示された。 線虫のC.elegansのゲノムには約2万個の遺伝子があることを考えると、これは驚くべきことです。 遺伝子数と生物の複雑さとの間に関連性がないことから、代替スプライシング（AS）が高等真核生物の制御・機能の複雑さ、タンパク質の多様性、生物の複雑さを拡大する主要な要因であると提唱され、関心が高まった。 しかし、多くの研究グループの最善の努力にもかかわらず、機能的革新（ここでは新規機能的転写産物の出現として理解される）の進化において AS が果たす実際の役割については、観察された生物の複雑性の増加を支えるものとして、まだほとんど理解されていません。 これまでの研究で、ヒトのマルチエクソン遺伝子の92％～94％が、組織や発生段階に特異的な方法でASを受けることが報告されています。 全ゲノム転写プロファイリングとバイオインフォマティクスアルゴリズムの開発・改良により、哺乳類ゲノムにおけるASの遍在性が明らかになりつつあります。 ヒト以外の種、例えばミバエ、シロイヌナズナ、その他の真核生物にASが高い割合で存在することが証明されると、一遺伝子一タンパク質という概念は姿を消した。 ASの理解と特徴の解明が進んでいるにもかかわらず、いくつかの疑問が未解決のままである。 第一に、種間における転写産物範囲の大きな違いが、異なる種における代替スプライシングの普及の直接比較を妨げてきた。 第二に、たとえ種間で比較可能なAS推定値が得られたとしても、進化に伴うAS有病率の変化がどの程度まで全体的なタンパク質の多様性に寄与しているか、あるいはむしろスプライシングノイズを反映しているかは不明である。 最後に、ASがどのように進化してきたのか、そしてそれが遺伝子の機能パラメータとどのように関連しているのかについては、ほとんど分かっていない。 ここでは、代替スプライシングがどのように制御されているのか、また代替スプライシングの進化に関する最近の理解について概説する。 1977年、Chowらはいくつかのアデノウイルス2（Ad2）mRNAの5′および3′末端配列が異なることを報告し、複数の異なるmRNAを生成する新しいメカニズムを示唆した。 この研究に続いて、哺乳類細胞の甲状腺ホルモンであるカルシトニンをコードする遺伝子においても、alternative splicingが発見された。 その後の研究により、他の多くの遺伝子もコーディング領域から異なる部分を切り出すことにより、2つ以上の転写産物を生成できることが明らかになった（総説あり）

切り出されたエクソンセグメントの位置、あるいはイントロンが残されるかどうかにより、スプライシング現象は4つの基本タイプに分類できる（図1）。 1）エキソンスキッピング（2）イントロンの保持（3）代替5スプライシングサイト（5′ss）、（4）代替3スプライシングサイト（3′ss）です。 さらに、相互排他的エクソン、代替的開始、代替的ポリアデニレーションは、様々な転写産物を生成する他の2つのメカニズムを提供する。 さらに、異なるタイプの代替スプライシングがコンビネーター的に起こり、1つのエキソンに複数のASモード、例えば、5′ssと3′ssが同時に起こることもある（図1）。 各タイプのASの有病率は、異なる分類群間で異なることが分かっている。 いくつかの研究により、エクソンスキッピングは後生動物ゲノムで一般的であるのに対し、イントロンの保持は植物や菌類で最も一般的なASのタイプであることが示されている

Alternative splicingはcis要素とそれに結合する転写因子により厳密に制御されている． トランスアクション因子は主にRNA結合タンパク質であり，スプライソソームや，エクソニック・スプライシング・エンハンサー（ESE），エクソニック・スプライシング・サイレンサー（ESS），イントロンスプライシング・エンハンサー（ISE），イントロンスプライシング・サイレンジャー（ISS）といったシスエレメントの活性を調節する． ASの正規のメカニズムでは、セリン/アルギニンに富む（SR）タンパク質は通常ESEに結合し、不均一核リボ核タンパク質（hnRNP）はESSまたはISSに結合する傾向があることが示唆されている。 これらの制御因子がスプライシング機構において重要な役割を担っていることから、スプライシングコードを破壊するシス変異やトランザクティング変異は疾患の原因となることが知られている（総説あり）。 突然変異の15-60%は遺伝子のスプライシングパターンに影響を与えることによって病気を引き起こすと推定されている( and reviewed in ). また、ASは複数の内部翻訳開始点、RNA編集、mRNA崩壊、マイクロRNAや他のノンコーディングRNAの結合などの転写後の事象と組み合わさって制御されている可能性もあり、ASの非正規のメカニズムが存在することが示唆された。

最近では、代替スプライシングにおけるヒストン修飾の直接的な役割が報告されており、FGFR2、TPM2、TPM1、PKM2などの多くのヒト遺伝子において、ヒストン修飾（H3-K27m3）がクロマチン結合タンパク質を介してスプライシング制御因子の採用に影響を与えることによってスプライシング結果に影響を与えているという。 さらに、CTCFが促進するRNAポリメラーゼIIの休止がDNAメチル化とスプライシングを結びつけることが報告されており、遺伝的エピジェネティックマークによってスプライシング結果が発生的に制御されるという最初の証拠が得られている。 さらに、ノンコーディングRNAもまた、代替スプライシングパターンの重要な決定因子として浮上してきた。 したがって、これらの知見は、転写と代替スプライシングの制御におけるさらなるエピジェネティックな層を明らかにした。 したがって、少なくとも100種類の特定の血液細胞におけるゲノムワイドな遺伝学的およびエピジェネティック研究が提案されています。この研究は、高品質の参照エピゲノム（DNAメチル化およびヒストンマーキングアッセイを使用）と詳細な遺伝および転写ゲノムデータ（全ゲノム配列決定、RNA-SEQおよびmiRNA-SEQ）を提供し、特定の血液細胞のAS制御におけるエピジェネティック因子のゲノムワイドへの影響を評価する機会を与えてくれるでしょう。 比較エピジェネティクスの台頭により、トランスクリプトームの進化について異なる視点が得られると期待している。

代替スプライシングイベントの特定代替スプライシングは、ゲノムパラメーターのみから推定することは困難である。 ASの制御モチーフは数多く発見されているが、既知の代替スプライシングモチーフの存在は、その遺伝子が実際に代替スプライシングされていることを保証するものではない。 したがって、代替スプライシングパターンは、一般に転写産物のデータを調べることで評価される。 興味のある遺伝子については、相補的DNA（cDNA）ライブラリーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、代替スプライシングイベントを同定することができる。 この10年間で、ハイスループットのトランスクリプトーム技術が向上し、ゲノム規模で代替スプライシングパターンを評価することが可能になった。 スプライシングパターンを評価するために、トランスクリプトームデータの3つの主要な情報源、すなわち発現配列タグ（EST）、スプライスジャンクションマイクロアレイ、およびRNA配列決定（RNA-Seq）が使用されてきました。

ゲノム全体のトランスクリプトーム解析の最初の波は、大規模に行われたcDNAとESTの直接配列決定で、cDNA/EST配列を参照ゲノムに合わせることによって、代替スプライシングイベントを特定することを可能にしたものです。 ESTは、200-800塩基の長さで、cDNAライブラリからランダムに選択されたシングルパス配列リードであり、編集されていません。 現在、ヒトのESTは800万件（がん組織からの約100万件を含む）、約2000種のESTはdbESTに約7100万件登録されています。 しかし、ESTは低スループットのサンガーシーケンスに基づいており、組織、発生状態、および疾患について、大きく異なるレベルの感度を使用して集約されている。 スプライシングマイクロアレイは、オリゴヌクレオチドプローブで特定のエクソンまたはエクソン-エクソン結合をターゲットとする。 個々のプローブの蛍光強度は、異なる組織や細胞株における代替スプライシングエキソンの相対的な使用量を反映しています。 高密度スプライスジャンクションマイクロアレイは、既知のエクソンとASイベントを低偽陽性率でアッセイする費用対効果の高い方法である。 欠点は、既存のASバリアントと遺伝子構造についての予備知識が必要なことである。 さらに重要なことは、RNA-Seq や EST とは異なり、マイクロアレイは追加の配列情報を提供しないことです。

RNA-Seq は、数百万の短い配列リードを生成できることから、トランスクリプトーム解析の強力な技術として浮上してきました。 RNA-Seq 実験は、転写ランドスケープに関する詳細な情報を提供します。 ハイスループット・データの蓄積はますます進み、低頻度のAS事象や組織特異的、発生特異的なAS事象など、ASのさらなる側面を調査する機会がますます豊富になると思われます。 初期のデータセットは50bp以下のRNAリード配列からなり、1つの転写産物におけるAS事象の組み合わせに関する情報は限られていたが、短いリードの長さは今後10年間で増加し続けると思われる。 次世代シーケンサー（RNA-Seq）の能力が高まるにつれて、alternative spicingの研究は革命を起こすと思われます。 ヒトや他の生物種のトランスクリプトームの配列決定がより深く行われるようになり、異なる組織や発生段階におけるASイベントの発生やASの発現パターンについての理解が深まりました。

ESTsやRNA-Seqなどの配列ベースの技術のトランスクリプトアセンブリは、参照ゲノムと配列データの品質に応じて、アライン-テン-アセンブリまたはアセンブリ-テン-アラインのいずれかを使用することができます . 異なる転写産物を比較することで、AS事象を検出するアルゴリズムを採用することができる。 しかし、短い配列ではエクソンの組み合わせに関する情報が少ないため、単一のASイベントとは対照的に、ASアイソフォームを検出することはまだ困難です。 転写産物アセンブリとASアイソフォーム検出のためにいくつかのアプリケーションが開発され、異なる戦略とこれらのアプリケーションの比較は、以前にレビューされている。 真核生物ゲノムにおける代替スプライシングの有病率

最初の全ゲノム解析では、ヒト遺伝子の5～30％が代替スプライシングされていると考えられた（レビュー記事）。 ESTベースのASデータベースでは、ヒト遺伝子の40-60%でASイベントが確認されている。しかし、最近ではこの数字は何度も見直され、最新の推定では、ヒトのマルチエクソン遺伝子の94%までが、代替スプライシングにより2つ以上の転写物を生成しているとされている。 代替スプライシングが時間とともにどのように変化してきたかを理解することで、代替スプライシングが転写物やタンパク質の多様性や表現型の進化にどのような影響を及ぼしてきたかについての洞察を得ることができます。 菌類では、酵母のエクソン数が少ないため、ASはまれであると考えられている。 しかし、RNA-Seqを用いた最近の研究では、シロイヌナズナのイントロンを含む遺伝子の少なくとも約42%がオルタナティブスプライシングされていることが示唆されています。 RNA-Seqなどの次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトームの詳細な研究が進んでいることから、様々な真核生物からより高い割合でASが発見されることが期待されています。 一般的に動物は植物よりもASの発生率が高く、脊椎動物は無脊椎動物よりもASの発生率が高いと報告されており、異なる分類群間のASの有病率を比較しようとする研究がいくつかなされている。 しかし、これらの研究は、限られたデータに基づいているか、転写物の範囲の違いを補正することができなかった。 しかし、これらの既存のリソースは主に動物種に焦点を当てており、原生生物、真菌、および植物ゲノムのカバレッジが低いため、分岐した分類群の比較が困難である。 最も重要なことは、これらのリソースは、ASの検出率に大きな影響を与える、種内および種間の遺伝子間の転写産物カバレッジの差の効果を考慮に入れていないことです。 ランダムサンプリングは、転写産物カバレッジの偏りを最小化するために使用され、示されています（図2）。 我々は、同様の戦略が将来の比較ASデータリソースに採用されることを期待しています。

(a)

(b)

(a)
(b)

図2

全転写物数はAS検出に影響を与えるが、サンプリング法を用いることで偏りを補正することが可能である。 線虫の全転写物データセット(a)またはランダムサンプリング法(b)を用いて、転写物カバー率で割った遺伝子におけるAS検出(aおよびb)

5. 代替スプライシングは機能的か、それともほとんどがノイズに過ぎないのか？

無脊椎動物に比べて脊椎動物のASレベルの増加が確認された場合、現在のプロテオミクス資源の限界を考えると、代替スプライシング転写物がどの程度拡張プロテオームに翻訳されているかを評価することは困難である。 長寿、脳化、あるいは複雑化など、我々がヒトから最も連想する多くの表現型の進化は、有効な集団サイズの急激な縮小を伴っており、おそらくより複雑な生物における様々なゲノム特徴の増殖を説明している（ただし、参照）。 したがって、進化によるASの増加は異常なスプライシングに起因するものであり、したがってそれはいかなる機能的役割も果たさないという可能性もある . もし代替スプライシングが系統樹に沿って増加し、それが本当に機能的であるならば、次のことが予想される。 A）転写産物は早発停止コドンの発生率が低く、ナンセンス媒介崩壊に対して脆弱であるはずである。 ヒトとマウスの転写産物では、ASヒト転写産物の4％から35％が早発停止コドンを含んでいることが判明しています。 これらの転写産物はフレームシフトを引き起こす可能性のある非保存エクソンに富んでいることが分かっている。 早発停止コドンを含むAS転写物の割合が系統樹に沿って変化したかどうかは不明である。 B）ヒトの細胞で作られる低コピー数の代替アイソフォームのほとんどは非機能性である可能性が高いと提唱されている。 最近の研究では、癌に特異的な代替スプライシングバリアントが見つかることがありますが、これらのイベントのほとんどはシングルコピー・イベントであり、したがって癌の中核となる転写産物に寄与することはないと考えられています。 ASの保存レベルは、多くの生物種で研究されています。 ヒトとマウスの間では11％から67％の範囲と推定される。 注目すべきは、主要なASフォームは、マイナーなフォームに比べて保存レベルが高い傾向があることである。 例えば、C. elegansとC. briggsaeの間では、エクソンスキップが81％以上の保存レベルを示しているのに対し、イントロンの保持は28％である。 D）AS領域における識別可能な機能ドメインの存在は、AS転写物の機能関連性の指標となり得る。 我々の知る限り、モデル生物において、AS領域に機能ドメインが存在するという報告はない。 AS転写産物における機能ドメインの存在を調べるために、我々は、正常なヒト組織から得られた8,315,254のESTを解析して得られた267,996のASイベントセットをコンパイルしました。 その結果、タンパク質ドメイン予測のための14のアプリケーションを含むInterProScanを用いて、ヒトのAS領域の約50％が既知の機能コンポーネントを含むことがわかり（図3、の方法を参照）、ASの機能的役割の可能性を示唆した。 種間におけるAS領域の機能的ドメインの有病率のばらつきの程度はまだ調査されていないが、ASの進化に関するさらなる洞察を提供するであろう。 機能成分は、タンパク質ドメイン予測のためのPfam、シグナルペプチド予測のためのSignalP 3.0、膜貫通ドメイン予測のためのTMHMMを含む、14のアプリケーションを含むInterProScanを用いて同定されました。 PSORT II は、タンパク質産物の細胞内局在の推定に使用されました。 また、タンパク質の二次構造は、プロテインデータバンク（http://www.rcsb.org/pdb/）から抽出したタンパク質配列に基づくCLC Main Workbench 5.7で予測した。

以上の観察を総合すると、代替スプライシングイベントは進化を通して確かに保存されているものの、かなりの割合がそうではなく、一部はタンパク質プールに貢献しないノイジー転写スプライシングによるものかもしれないということがわかる。 しかし、比較可能なAS指標を用いたさらなる研究が行われるまでは、系統樹に沿ったASレベルの増加が機能的転写物のプールにどの程度影響を及ぼしているかを推定することは不可能である。

6. 選択的スプライシングと遺伝子重複

遺伝子重複 (GD) はゲノムにおける機能革新の主要な源と考えられている。 新たに重複した遺伝子は機能的分岐を進化させることができ、脊椎動物の発生や形態の複雑さを進化させる鍵になると考えられている。 また、タンパク質の多様性を高める有力なメカニズムとして、代替スプライシングが真核生物の進化に関与している可能性が提唱されています . 遺伝子重複と選択的スプライシングの関係を調べることで、両者がどの程度、タンパク質の多様化の手段として等価であるかをより理解することができる。 いくつかの研究により、ヒト、マウス、ワームにおいて、ASと遺伝子ファミリーのサイズとの間に負の相関があることが報告されている（表1）。 ASとGDは互換性があり、ワームからヒトまで普遍的な負の相関があるという結論を導き出すのは容易である。 しかし、この2つの変数の関係はせいぜい僅かであり、多遺伝子ファミリーに比べてASレベルが低いシングルトン遺伝子を含めると一貫性がない。 Jinらは、シングルトンはデュプリケートよりも進化的に狭窄しており、ASアイソフォームの獲得を妨げていると示唆した。この仮説と一致して、Linらはシングルトンはマルチジーンファミリーといくつかの点で異なっており、進化の経路が異なっていることを示唆する結果を得た。 多遺伝子ファミリーだけに注目しても、ASと遺伝子ファミリーサイズの負の相関は、ASと遺伝子ファミリーサイズが他の因子と共分散することで説明されるか、副産物である可能性がある。 例えば、遺伝子年齢や偏った重複が説明として提案されている 。 この研究はASとGDの関係に疑問を投げかけ、ASとGDはタンパク質の配列、構造、機能への影響に関してほとんど同等でないという指摘を確かに支持するものであるかもしれない。 ほとんどの研究が少数のモデル種を調査しているため、ASとGDの関連性の程度を評価することは困難である。 さらに、1つのゲノムでGFSとASを比較するというスナップショット的なアプローチは、ASとGFSの真の関係を隠してしまうかもしれない。

7. 機能革新へのAlternative Splicingの貢献

Alternative Splicingは、過去8億年の間、後生動物の遺伝子数がほぼ一定であるにもかかわらず、より複雑な進化の原因となったゲノムの失われた情報源と賞賛された。 Wegmannらは、遺伝子発現の幅が新しい転写産物アイソフォームの数と正の相関があることを見出し、遺伝子発現の幅の増大が新しい転写産物アイソフォームの獲得に必須であり、それが新しい形のバランス選択によって維持されている可能性を提案した。 さらに、実験およびバイオインフォマティクス解析により、ASは、細胞分化、性分化、および発生における特定の段階と同様に、異なる安定性特性、細胞内局在、および機能を示す、さまざまな機能的mRNAおよびタンパク質産物を生成できることが示されている

単一遺伝子研究により、遺伝子重複が起こる前にオルタナティブ・スプライシングによって機能の革新につながる事例が示されている。 そのような例の 1 つが、筋収縮に重要な役割を果たすトロポニン I (TnI) です。 TnIは、脊椎動物のゲノムには3つのコピーが存在し、それぞれ異なるタイプの筋肉（骨格筋、速筋、遅筋、心筋）で発現している。 一方、脊椎動物に近いCionaでは、TnIは1つの遺伝子として存在している。 しかし興味深いことに、Cionaの遺伝子は3つの異なる交互スプライシングされたアイソフォームを生成し、それぞれが脊椎動物の遺伝子の1つの発現プロファイルに類似していることがわかった。これは、TnIタンパク質がそれぞれの筋タイプで機能するように特化することが遺伝子重複事象より先に起こったことを示唆している。 このように、祖先が単一であった遺伝子が、後に重複した遺伝子の発現プロファイルに類似しているというパターンは、四肢動物のシナプシン-2遺伝子や魚類のMITF遺伝子でも見つかっている … 続きを読む これらの例は、代替スプライシングが、3つの可能な経路のいずれかを通じて、遺伝子重複の事象に先行する機能革新のメカニズムになり得ることを示唆している（図4）。

(a) スプライシングシグナルの変性

(b) ノンコーディングDNAのエクソナリゼーション (b) トランスポゾンがエクソニゼーションされる。コーディングDNAまたはトランスポゾン

(c) エクソン重複とアイソフォームの特殊化

(a) スプライシング信号の退化
(b) 非コーディングDNAまたはトランスポゾンのエクソニゼーション
図4