AI-1 signal controlled cell growth rate
E. coli cell growth rate control through transcriptional regulations that involved sugar transport, we first tested the E. coli cell growth rate control from ptsH. HPr（ptsHにコードされる）は、phosphoenolpyruvate（PEP）からグルコース（または他のPTS糖質）にリン酸基を順次転移する一連のタンパク質（例えば、E1、HPr、EII）の一つとして広く認知されている34。 HPrは高度に保存されている37。 最近、HPrはAI-2キナーゼLsrKと相互作用し、AI-2の取り込みに影響を与えることを発見した35。 このHPrのAI-2調節機能は、後にAI-2感知細胞を構築する際に活用された。 ここで、ptsH変異株はグルコースを含む最小限の培地において野生型株より成長が遅いことを示した（補足図1a）。 また、ptsH変異体においてptsHをIPTG誘導性プロモーター下に置くと、IPTG添加量に応じて増殖速度を制御することができた（補足図1b）。 重要なことは、ptsHの発現を誘導すると、細胞増殖速度が増加することを実証したことである。 同様に重要なことは、この挙動は培地が主要な炭素源としてグルコースを含むかどうかに関係なく起こることである（補足図1c）。
この概念実証に基づき、次にQSシグナル制御成長速度を設計した。 コントローラ株を構築するために、ptsH変異株PH04のプラスミドpAHL-HPr（図2a）上のAI-1 lasI QSプロモーターの制御下にptsHが置かれた。 プラスミド上の他の場所では、細胞の可視化のためのdsRedExpress2と、lasIプロモーターの活性化に必要なLasRの両方が、構成的T5プロモーター下で発現していた。 コントローラ株にAI-1を添加すると、用量依存的に細胞増殖速度がベースラインの1.8倍まで増加した（Fig. 2b）。 測定された比増殖率（AI-1添加後1時間から4時間の間）は、AI-1レベルに基づく増殖率のMonod型モデルの基礎となった（図2c）.
AI-1クォーラムセンシング信号がHPrの発現を介して成長速度を制御した。 a AI-1成長応答性コントローラー細胞（PHAHL-HPr）の模式図である。 AI-1はLasR（構成的発現）と結合し、lasプロモーターを活性化し、HPrを発現させ、細胞の成長速度を増加させる。 培養液はOD 0.15 (t = 0)まで増殖させ、40分後にAI-1を添加した（矢印で示す）。 表はAI-1添加後1時間から4時間までの平均成長速度を示す。 c 異なるAI-1濃度での基礎成長速度（0.28または0.32 h-1のいずれか）に対する成長速度が2つの別々の実験（黄色とオレンジ色の点）に対してプロットされている。 AI-1の関数として相対成長速度を記述する関数fHPrがプロットされている（青線）。 a = 1, b = 1, c = 29, d = 2.1, e = 0.48。 ソースデータはSource Data file
AI-1はコントローラー細胞の共培養で組成を調節する
次にAI-1を調節したコントローラー細胞を他の株と共培養し、AI-1を添加すると共培養の組成が変化することを検証しました。 赤色蛍光タンパク質を発現する成長制御細胞（PH04 pAHL-ptsH）を、PH04 pCT6またはTOP10 pT5G7のいずれかと共培養した。 PH04 pCT6 は PH04 pAHL-ptsH と同程度のベースライン増殖速度であるが、TOP10 pT5G は著しく速い増殖速度である。 培養は、ほぼ等しい細胞密度で接種し、様々なAI-1レベルで補充した。 8時間後、サンプルを採取し、蛍光顕微鏡で分析し、ImageJで定量した。 予想通り、コントローラー細胞をPH04で培養した場合、AI-1濃度の増加とともに培養組成が増加した（Fig. 3a）。 また、TOP10と培養した場合、TOP10の方が増殖速度が速いにもかかわらず、同様の傾向が見られた（Fig. 3b）。 すなわち、AI-1無添加の共培養では、TOP10共培養におけるコントローラー細胞の割合は、8時間の間に最初の約0.5から約0.09へと大幅に減少した。AI-1を添加すると、この成長速度の差を打ち消し、同じ8時間の間にコントローラー細胞がより多くなる結果となった。 これらの結果は、培養中の他の菌株やそれぞれの増殖速度に関係なく、AI-1（大腸菌QSシグナル分子ではない）が人工制御株の増殖速度を調節し、その変化は、特に比較的短期のバッチ条件（供給バッチ、反復バッチ、連続培養とは異なる）であっても培養組成の変化を観察できるほど十分に速く起こることを示している。
AI-1 regulates cell growth rate in co-cultures. a PH04 pAHL-HPr（HPrと略称）はPH04 pCT6（略称）と共培養される。 各培養液は0.5%接種し、初期HPr分率は〜0.5とした。 AI-1量は接種時に添加した。 b PH04 pAHL-HPr（HPrと略す）をTOP10 pT5G（TOP10と略す）と共培養したもの。 各培養液は0.5%接種し、初期HPr分画は〜0.5とした。 指示されたAI-1レベルは、接種時に添加された。 サンプルは8時間後に共培養組成を分析するために採取した。エラーバーはテクニカルトリプリケートのs.d.を表す。 c PH04 pAHL-HPr（HPrと略す）は、1μM PYO誘導ありまたはなしのPH04 pSox-LasIと共培養した。 共培養におけるHPrの初期分画は〜0.5であった。 2時間後と4時間後にAI-1測定用サンプルを採取し、5時間後に共培養組成分析を行った。エラーバーは生物学的二重鎖のs.d.を表す。 ソースデータはSource Dataファイルとして提供される
次に、AI-1制御コントローラ株を、誘導されるとAI-1を産生する細胞と共培養させた。 PH04 pSox-LasIとPH04 pAHL-HPrは一緒に共培養した。 プラスミドpSox-LasIは、ピロシアニン誘導性soxSプロモーター7下に、AI-1を合成するlasIを含んでいる。 この実験では、コントローラ株はトランスレータ株からのシグナルを受けて、今度はピオシアニンに応答してAI-1を産生する。 このように、共培養制御方式は、特定の分子的な手がかりに反応することが示されている。 ここでは、各培養物をほぼ等しい開始密度で接種し、共培養物をピロシアニンに曝すか曝さないかのいずれかにした。 曝露した培養物では、5時間以内にAI-1の産生が増加し、それに伴ってPH04 pAHL-HPrの組成が増加した（Fig. 3c）。 これらの結果は、代替菌株から生産されたAI-1が制御菌株の増殖速度に影響を与えること、そしてそれがバッチプロセスで変化に影響を与えるのに必要な時間スケールで起こり得ることを示す。 さらに、この結果は、分子または誘導剤（この場合はピロシアニン）のユーザー特異的な適用に基づくユーザー制御型共培養の実現可能性を示している。
AI-2を感知するトランスレーター細胞の設計
AI-2を感知しAI-1を生産する細胞株を構築するために、AI-2 lsrプロモーターが活性化されるとAI-1を合成するLasIの発現が活性化するように株を工学的に設計した。 弱いlsrプロモーターからの発現を増幅するために、2つのプラスミドシステムを用いた25 (Fig. 4a)。 簡単に説明すると、AI-2はLsrKによってリン酸化され、リン酸化されたAI-2はLsrRによるプロモーターの抑制を解除し、lsrトランスポーター遺伝子の転写を増加させてAI-2の取り込みを促進させる。 同時にAI-2を介したlsrプロモーターの活性化はプラスミドpCT6からのT7 RNAポリメラーゼの転写とそれに続くプラスミドpET-LasIからのlasIの転写をもたらす
Engineered translator cells produce AI-1 in response to AI-2. a translator cells couple the AI-2 and AI-1 quorum sensing circuits using a dual plasmid system.その結果、AI-2およびAI-1クォーラムセンシング回路は、二重プラスミドシステムを使用して結合した。 リン酸化されたAI-2はT7 RNAポリメラーゼの発現を活性化し，それに続いてAI-1を合成するLasIを発現させる． AI-2は〜OD 0.1で示したように添加し、6時間後にAI-1測定のための試料を採取した。 エラーバーは技術的二重性間のs.d.を表す。 ソースデータはSource Data file
このシステムは、まず大腸菌宿主株CT104で構築されたが、これはluxS変異体（例えば、AI-2を生成できない）である。 CT104はリン酸化されたAI-2シグナルを分解する役割を持つlsrFGも欠き、AI-238に対する細胞の感受性を高めている。 この細胞株CT104 pCT6 pET-LasIをAI-2産生BL21の調整培地（CM）で培養したところ、AI-1を産生することを確認した（補足図2）。 BL21を様々な細胞密度に増殖させ、CMを回収し、回収したCMでCT104細胞を増殖させた。 重要なことは、CT104細胞が産生するAI-1は、AI-2産生BL21細胞の密度と相関していたことである（補足図2a）。 また、AI-2産生細胞の割合が異なるコンソーシアムに添加したトランスレータ細胞が、コンソーシアムの構成に応じたAI-1シグナルを産生できるかどうかを検証した。 CT104細胞をBL21（luxS+）とBL21 ΔluxSの比率を変えた培養物に添加した。 6時間後、細胞外培地中のAI-1シグナルのレベルは、培養組成を示すものであり、これは、今度は、主にluxS+細胞の初期画分に基づく25（補足図2b）。
上記の実験により、AI-2生産細胞からAI-2に応答してAI-1を生産する細胞株が構築できることが実証された。 これらの実験はLB培地で行い、グルコースを含む培地では行わなかった。 グルコースの存在はAI-2の取り込みとlsrプロモーター活性を阻害する39。CT104細胞の使用はグルコースのない培地に限定できる可能性がある（AI-2 QS経路のスキームは補足図3参照）。 そこで、AI-2 QSシステムの知見に基づき、グルコース含有培地においてAI-2の取り込みとldsrプロモーターの活性化が可能な菌株の作製を試みた。 こうすることで、我々の成果をより一般的に応用することができる。 我々は以前、HPr（ptsHによってコードされる）がLsrKと相互作用し、LsrKキナーゼ活性を阻害すること、ptsH変異体がグルコースを含む培地でもAI-2を取り込むことを明らかにした35。 従って、PH04（ΔptsH ΔluxS）を宿主株として用いれば、グルコースを含む培地でもAI-2をベースにしたAI-1の生産が可能になるのではないかと考えた。 両宿主株を用いて、LB培地とM9グルコース培地でAI-2添加、無添加のトランスレータ細胞のテストを行った。 AI-1の産生レベルはAI-2の添加に依存するが、宿主株と培地にも依存した（Fig.4b）。 AI-2を添加したLB培地に細胞を添加した場合、両菌株ともAI-1を産生した。 予想通り、M9培地では、CT104宿主株を用いた場合、AI-2の添加と無添加の培養物を比較すると、AI-1活性の倍率変化は小さいか、あるいは重要でなかった。 しかし、重要なことに、PH04トランスレーター細胞は、M9＋グルコース培地においてAI-2によるAI-1の活性化産生を示した。
PH04トランスレーター細胞の特性
PH04トランスレーター細胞はAI-2シグナル分子を取り込み、LasIの発現を活性化してシグナルを伝達し、AI-1を合成し分泌する。 AI-1の出力はAI-2の入力の関数である。 我々は、PH04トランスレーター株におけるAI-2シグナルによるAI-1産生を、生物学的に適切なAI-2濃度の範囲で、経時的に評価した。 PH04トランスレーター細胞によるAI-1産生速度はAI-2の用量に依存することが分かった（図5a）。 我々は、これらの条件および類似の条件下では、AI-2はほとんど4時間以内に消費されることに注目している（Fig.5b）。 AI-2またはAI-2に基づくAI-1の生産物をこれらのバッチ培養に添加しても、細胞増殖の観察可能な減少は見られなかった（Fig.5c）。 次に、AI-1のデータからロジスティック関数をプロットし、この式の時間微分を求め、時間微分を細胞密度で割って（補足表1）、時間依存の比生産速度を得ることにより、試験した各AI-2濃度における細胞あたりのAI-1生産速度を特徴付けた。 図5dは、AI-2添加量とAI-2添加後の時間の関数として、細胞あたりのAI-1産生率を推定したプロットである。 後で示すように、これは、最初の合図に対する遺伝子発現の軌跡はかなり強固であるという、我々が観察した根本的な観察と一致する21,38,40。
トランスレータ細胞におけるAI-1の生産の特徴付け。 AI-2の濃度を変えたM9グルコース培地で培養したPH04トランスレーター細胞。 細胞は一晩培養したものを接種し、AI-2はt=0で示したように添加した。 エラーバーは技術的二重測定のs.d.を表す。 b 細胞外AI-2活性の経時変化。 c 細胞密度の経時変化。 d AI-2濃度を変えた場合のAI-1産生率fAI1関数（実線）および実験データから計算したAI-1産生率（点）。 ソースデータはSource Data file
次に、PH04トランスレーター細胞が産生するAI-1がAI-1応答性コントローラー細胞の増殖速度に与える影響を検証した。 すなわち、AI-2のレベルを変化させたトランスレーター細胞からのAI-1を含むCMに成長反応性細胞を加え、〜3時間培養した（補足図4a）。 この実験は、Fig.5で示したAI-2への直接暴露からAI-1が生成されることを超えて、AI-2からAI-1への細胞翻訳が、第二集団の成長速度に影響を与えるように必要な発現と細胞培養動態で行われうることを示している（Supplement Fig.4b）。 この観察は、後の共培養実験ではより劇的なものとなった。
共培養組成の自律的制御
次に、翻訳細胞（集団Aと呼ぶ）とAI-1に応答するコントローラー細胞（集団B）を、様々な初期AI-2濃度を持つ溶液に加えた。 トランスレーター細胞とコントローラー細胞の共培養では、トランスレーター細胞は初期AI-2レベルに基づいてコンソーシアム構成を自律的に制御している。 補足図5において、初期AI-2量を増やした共培養では、AI-1が増加し（補足図5b）、それに伴いPopulation Bの相対量も増加した（補足図5a）。 これらの結果は、シグナルを介したコンソーシアム集団の自律的な制御という概念を示した。 また、集団Aと集団Bの成長速度の推定値は、単培養実験で測定した成長速度の期待値と一致した（補足図5c）。
次に、トランスレータ細胞がAI-2の曝露に基づいてコンソーシアム構成を制御できることを証明した後、システムのダイナミクスを特徴付ける数学モデルを開発した。 このようにして、特定の初期条件や成長率設計などが与えられた場合の共培養の挙動を予測し、所望の出力を目標とするために必要なパラメータを決定することができるようになったのである。 この概念的に単純な数学モデルは、個々の菌株のデータを用いて共培養の挙動を予測するために作成されました。 このモデルは4つの常微分方程式からなり、個体数密度、基質濃度、AI-1濃度にそれぞれ1つずつ対応している（補足表2、3）。 細胞の増殖と基質濃度のモデルには、一定の収量係数を持つMonod成長速度論を用い、QS分子の生成や効果を考慮した関数を追加した。 Population Aが産生するAI-1は、AI-2の曝露量と時間（fAI1）の両方に基づいている。 以前の研究38で、我々は細胞の行動の時間依存的な軌跡が自己誘導体への最初の曝露の結果であることを見出したので、AI-1産生の時間依存的な機能はここでもっともらしいと思われる。 Population Bの成長速度はAI-1の優勢レベル（fHPr）に基づき定式化された。 最大比増殖率は実験データを用いて測定し，収量は実験的に観察された定常期密度と既知の初期基質濃度に基づいて推定し，K1およびK2値はグルコースの文献値に基づいて選択した。 MATLAB (Version R2016a) ode45 ソルバーを使用して、ODE のシステムを解いた。 このモデルは、これらの単純な現象論的速度方程式とベストフィット定数を与えると、共培養集団が時間とともにどのように変化すると予測されるかを示すために使用することができます。 前述のように、このモデルは、バッチ培養で得られる限られた時間の中で、共培養が進化すると予測できるかどうかを判断するための基礎となるものである。 重要なことは、単培養からの我々の結果は、共培養からの実験結果をシミュレートするために使用されることである
つまり、我々は次に、モデル予測によって自律的にプログラムされた共培養制御を評価したのである。 集団Aと集団Bの共培養を初期細胞集団の範囲に合わせて配置し、その後、集団の軌道を動かすために、規定レベルのAI-2を添加した培地に添加した。 本システムでは、共培養で供給される細胞の比率に基づいて初期組成を選択し、その後、培地中のAI-2レベルに基づいて培養組成を経時的に自律的に調整する。 結果を我々のモデルと比較した。 Fig.6に、初期A:B比やAI-2レベルを変化させた場合の5時間後の共培養組成とAI-1レベルを示した。 これらのテストでは、1つの初期集団の細胞密度を使用しました。 重要なことは、我々のモデルがAI-1レベルと共培養組成の両方の実験結果をよく予測することが分かったことである。 また、このモデルは、目的の出力を得るための初期条件を選択するために使用することができることにも注目したい。 例えば、5時間後の相対細胞密度が55％のPopulation Bを目標とする場合、初期条件としてA：B比を60：40、AI-2濃度を40μMとして共培養を開始することが可能である。 他のシナリオもテストされ、検証された（図）。 これらの結果は、細胞組成の初期条件（例えば、A:Bの比率）と異なるレベルのAI-2への曝露の両方が共培養集団の軌道に影響を与えることを明確に示している。 しかし、同様に重要なことは、直交するシグナル分子であるAI-1がモデル通りに挙動したことである。 1416>
Predicting co-culture behavior using mathematical model.このシグナル分子や他のトランスレーター シグナルを含めることにより、さらに、多様なまたはより複雑なコンソーシアムの設計や制御が可能になると予想される。 AとBの共培養を、様々なAI-2濃度を含む培地に加え、AI-1（左）と共培養組成（右）の測定用サンプルを5時間後に収集した。両細胞株は、組み合わせた初期ODが0.05となるように一晩培養から植え付けたものである。 A:Bの初期比率を示す。 対照「C」は、PH04 pAHL-HPrの代わりにPH04 pAHL-sfGFPを集団Bとして用い、0 µMのAI-2を含む培地を使用した。 モデル結果、実験結果の両方を示す。 エラーバーは、技術的二重測定（AI-1測定）および技術的四重測定（組成測定）間のs.d.を示す。 ソースデータは、ソースデータファイル
として提供される。すなわち、トランスレーター細胞の特徴付けに使用されたAI-2濃度よりも高い、モデルがないAI-2濃度、80μMに曝露して共同培養コントローラーシステムをテストした。 共培養の結果（Fig.6）をもとに、このAI-2濃度でのトランスレータ細胞の単培養での挙動を推定した。 次に、トランスレータ細胞に80μMのAI-2を加えて単培養実験を行い、共培養のデータとモデルを用いて単培養の挙動を予測できることを示した。 補足図6aは、共培養データとモデルから予測されるAI-1産生速度（線）と、単培養実験中の実際のAI-1産生速度（データ点）である。 補足図6bは、単培養における予測されたAI-1レベルを、実際に測定されたAI-1レベルと経時的に比較したものである。 AI-1産生量の推定値と単培養体の初期細胞密度を入力し、モデルを用いてAI-1レベルの予測値を決定した。 ここで、我々の目的は、単純なバッチ培養で初期組成を変化させ、一定のAI-2レベルに曝露することによって得られたものを超えて、集団の軌跡を拡張することであった。 このようにして、制御スキームの頑健性を検証しています。 例えば、Fig.6では、最初に人口Bが約40%の培養では、人口Bが60%に近づくレベルに達するには、高レベル（>80μM）のAI-2に暴露しなければならないことが分かった。 バッチシステムを繰り返しテストすることで、単に再懸濁し、時間的にシステムを延長することで、B集団を80%以上にまで追い込むことができると考えた。 AI-2濃度を変化させた培地に共培養細胞を加え、3時間ごとにAI-2を追加した新しい培地に再懸濁させた。 各再懸濁の直前にサンプルを採取し、AI-1濃度と細胞培養組成を分析した（Fig.7a, b）。 細胞密度とAI-2活性も測定された（補足図7）。 このように、より複雑な実験セットアップにおいても、システムは概ね設計通りに機能することが分かった。 より少ない量のAI-2（20μMと40μM）を曝露することで、ほぼ80%の集団Bに到達できることがわかった。しかし、このテストの間に、実験結果が数学モデルで予測される結果と乖離していることが判明した。 そこで、3時間ごとのAI-1産生量と培養物の成長速度を詳細に観察し、単純なモデルとの乖離から培養のダイナミクスを理解することにした。 例えば、2回目と3回目の3時間サイクルで産生されたAI-1は、モデルで予測されたよりも高い値を示していた。 これは、最初のバッチサイクルの後、細胞は既にLasI（AI-1を合成する）を生産しており、追加のAI-2がLasIの更なる生産を誘発したと考えられる（我々はLasIに分解タグを付けていないので、その維持は予想されたはずである）からである。 そこで、新しい培地への再懸濁の開始時のAI-1産生速度が、前回の終了時と同じになるようにモデルを調整した（Fig. 7c、実線）。 これらのAI-1産生に関する新しい関数をモデルに組み込むと、AI-1の値は実験的なAI-1データにほぼ適合した（図7a、実線のモデル）。 同様に、コントローラ細胞の成長速度を推定したところ（補足説明1参照）、成長速度とAI-1濃度との組み合わせは、先のfAI1関数に適合しないことが分かった（Fig. 7d）。 なお、コントローラ細胞の成長速度を計算するために、トランスレータ細胞の成長速度は一定であると仮定したが、AI-2を繰り返し添加した結果、わずかに減少した可能性がある。 コントローラーの成長速度は、最初はAI-1の関数として増加するように見えたが、その後新鮮な培地に再懸濁すると、全体の成長速度は減少した。 我々は以前、HPrとLasIを過剰発現させると、成長速度がダイナミックに低下することを指摘していた（補足図4、5）。 このことから、高濃度のAI-1に繰り返しさらされることによる細胞への代謝的負荷、あるいは基質や栄養レベルの低下が、後のサイクルにおける成長速度の低下の原因であると考えられる。 重要なことは、AI-1の成長率への影響が時間とともに減少するようにモデルを調整することにより（補足注2参照）、モデルを複雑にすることなく実験データに適合させることができた（図7b、実線の調整モデル）
反復バッチ設定における共培養システム。 AとBの共培養体を、指示されたレベルのAI-2を含む培地中で全出発ODが〜0.05となるように接種した。 3時間ごとに培養液をスピンダウンし、AI-2を含む新しい培地に再懸濁した。 再懸濁の前に、AI-1レベルおよび共培養組成分析のためにサンプルを採取した。 a 接種時（t = 0）と各3時間セグメント終了時の培養物中のAI-1レベル。 データポイントは実験データ、線は調整済みモデルを表す。 エラーバーは生物学的二重層間のs.d.を表す。 b 接種時（t = 0）および各3時間セグメント終了時の集団Bの分数。 データポイントは実験データを示す。 実線は調整モデルによって予測された母集団Bの割合。 破線は調整モデルで予測された母集団Aと母集団Bの成長率の差を示す。 c 元のモデル（破線）および調整モデル（実線）で使用した各AI-2レベル（fAI）に対するAI-1産生の経時変化率。 d データポイントは、各3時間セグメントおよび各AI-2濃度に対する時間平均成長率（集団B）対時間平均AI-1濃度である。 成長率およびAI-1の推定に関する詳細は、補足説明1を参照。 破線は元のfHPr関数を示す。 ソースデータはSource Data file
以上のことから、我々の共培養システムは、AI-2を含まない培地に置いた場合でも、AI-2を高濃度に加えた場合でも設計通りの反応を示すことがわかった。 さらに、コントローラ細胞の40から80%に及ぶ制御可能な集団密度を示す結果となった。 また、我々のオリジナルモデルとの比較により、このシステムがこのより複雑な実験セットアップでどのように振る舞うかについての洞察を得た。トランスレーター細胞は時間とともに高レベルのAI-1を産生するように見えたが、コントローラー細胞は時間とともにAI-1による成長率の変化が減少するように見えた。
最後に、このモデルは、自律的に制御された培養（シグナル制御成長率およびネイティブ細胞-セルシグナルにより特徴づけられる）に今回用いた戦略が、ユーザー制御または動的制御可能なプログラミングシステムなどの他のシステムへ拡張可能かをインシリコ的に探るための基礎を提供するかもしれない。 例えば、ケモスタット培養は、その出力が希釈率などのユーザー指定入力によって指示されるという点で、現在の自律系と区別される。 最初の試みとして、バッチモデルに標準的なフロー項を追加して、ケモスタット栽培の共培養のシミュレーションを行いました（補足図8、補足表4、5）。 その結果、いくつかのケースでは、希釈率が定常状態の培養組成を定義し、その後、希釈率に制約された範囲内で「チューニング」できることがわかった。 この「調整」は、例えば、シグナル分子を外部から添加するなどして、細胞間シグナル伝達を調節することで達成できる。 これらのケースは、我々の自律的なシステムと他のユーザー制御のシステムとの相互作用が、より複雑な集団の軌跡をもたらす可能性を示している。 このシミュレーション結果は、より複雑なユーザー誘導型システムにおいてコンソーシアム構成を制御するための概念的な枠組みを提供するものである。 サーモスタットシミュレーションの詳細については、補足説明3
を参照されたい。