Frontiers in Veterinary Science

Introduction

レーザー治療は獣医学において、リハビリテーションと治療の両方の目的で使用されている新しいリハビリテーション技術である。 レーザー治療による光生物調節（PBM）は、近赤外スペクトル内の電磁放射の応用であり、標的組織内の治癒または鎮痛を刺激することを目的としている。 現在、レーザー治療は、筋骨格系の痛み、変形性関節症、関節痛、炎症、神経障害性疼痛、耳炎、皮膚炎、慢性または治癒しない創傷、脱落性潰瘍など様々な症状に対して提唱されています（1-5）。 炎症期は、傷害時に始まり、止血と血小板栓の形成で始まる。 血小板は血小板由来成長因子を放出し、好中球を引きつけ、さらに重要なことはマクロファージを引きつけることである。 マクロファージは線維芽細胞を引き付け、増殖期を開始する。 線維芽細胞は、筋線維芽細胞に分化し、組織の収縮を引き起こす。 コラーゲンの再編成により引張強度が増加し、最終的には、傷のない組織の強度の80％に達する創傷が得られる（6, 7）。 レーザー治療は痛みを軽減し、創傷治癒の炎症期、増殖期、成熟期にプラスの影響を与え、創傷の引張強度を増加させることが実験的に示されている（6、8-10）。 しかし、これらの研究のほとんどは実験動物におけるものであり、種間の創傷治癒の違いを考慮していない。

ヒトと獣医学の両方のための様々なアプリケーションにおけるレーザー治療の潜在的なプラスの効果についての多くの説明にもかかわらず、様々な条件、および組織の治癒のための正確なプロトコルは存在しない。 獣医学における最近の研究は、レーザー療法によって誘発されるPBMを用いた創傷治癒の潜在的な利益を示しており、波長635nm、ダイオードあたり17mWのエネルギー出力、5.1J/cm2のパワー密度を用いた馬の遠位肢の創傷の治癒促進が含まれている（11）。 別の最近のイヌの研究では、波長810nm、エネルギー出力200mW、パワー密度2-8J/cm2を用いて、椎間板ヘルニアに起因するT3-L3脊髄症のイヌにおいて、PBMと組み合わせた手術により歩行までの時間が短縮することが示された(4)。 文献上の他のレーザー治療に関する報告を見ると、創傷治癒プロトコルは1～40J/cm2と様々であり、その結果、定義された臨床適応症のために特定の標的組織で特定の出力密度を使用して提案されたプロトコルの有効性を評価するために、対照研究調査が引き続き必要である（8、12～17）。 写真を用いたこの瘢痕尺度は、瘢痕化粧が組織学的治癒の一貫した鋭敏な指標であり、審査員に依存しないことを多数の種で示している（3、18-21）。 本研究では、レビュアーに盲検化されたデジタル写真を用いることで、組織サンプルの採取を避けながら治癒を評価することができた。 本研究の目的は、犬の椎間板疾患（IVDD）患者の外科的切開治癒の治療方法としてのレーザー治療の使用を客観的に評価することである。

材料と方法

すべての手順は、ミシシッピー州立大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されており、すべての治療およびコントロール動物参加者が研究への登録前に文書によるクライアント同意をしていた。 切開治癒をスコアリングするための獣医師の使用は、ミシシッピ州立大学研究対象者保護に関する施設審査委員会によって承認された。

胸腰部における半月板切除のためにミシシッピ州立大学獣医学部に来院するダックスフント患者が、この研究に含まれた。 ダップルカラーの被毛を持つダックスフンド、全身的な健康問題が知られているダックスフンド、ステープルで閉じた切開部、同意しない飼い主は本研究に含まれなかった。 また、過去に背中の手術を受けたことのある犬も、研究対象には含まれなかった。 対象基準を満たした犬には、シグナルメント、体重、ボディコンディションスコア、毛色、椎間板ヘルニアの位置、外科的切開の長さ、使用した縫合の種類、脂肪パッドグラフトまたはジェルフォームの使用、ステロイド投与、膀胱薬、提示時および退院時の神経学的状態に関するデータを収集した。 写真は、0日目を手術日として、0、1、3、5、7日目、21日目に全ての犬で同じ距離（15cm）、角度、設定、照明で再度撮影された。 すべての写真は、切開部からの距離を統一し、同じ診察台で、同じカメラ設定で、犬の背中から90°の角度で、著者2名のうち1名（KGまたはAW）が撮影した。

デジタル写真を用いた臨床的瘢痕スケールは、以前に記載したように作成した(18)。 最初に提示された3頭の犬は、私たちの参加基準を満たし、記載された標準化された変数を用いて0、1、3、5、7、および21日目にデジタル写真を撮影した。 この3頭の犬を用いて、0から5までの瘢痕スケールを作成した。0は新鮮な外科的切開（0日目の写真）、1は新鮮な切開だが出血はない（1日目の写真）、2は多少のかさぶた、腫れ、あざのある切開（2日目の写真）である。 スコア3は、皮膚のリモデリングが進行しているが、あざや炎症が治まり、治癒が確認できる状態（5日目の写真）、スコア4は治癒が進行しているが、瘢痕が確認できる状態（7日目の写真）、スコア5は上皮化、収縮、発毛を伴う手術切開部の完全治癒（21日目の写真）（図1A、B）であった。

研究に登録された最初の3匹の犬は、合併症なしに適切かつ期待される治癒を保証するために選択され、写真撮影された。 最初の3匹の犬が視覚的に代表的な瘢痕スケールを作成するために使用された後、次の資格のある犬は、コインフリップを使用して2つの治療群（レーザーまたは非レーザー）のいずれかに割り当てられました。 その後の犬は、治療グループの大きさが同じになるように、1頭おきに割り当てられた。 レーザー治療犬には、クラス3Bの動物用レーザー2 を用いて、1日目から7日間、毎日8J/cm2 のレーザーを照射した。 レーザーは、レーザーメーカーから提供されたNovusポリッシュシステムの布で、患者の前後にきれいに拭き取られた。 切開部および切開部全体（頭側、切開部の長さの両側、尾側）の周囲の追加プローブヘッドスポットサイズ（7.55cm2）は、椎弓切除部位を除いて処理された。 切開の長さが異なるため、患者の総照射時間は変化した。 プローブ3は、常に皮膚に垂直に接触させ、圧力をかけずに使用した。 メーカーがあらかじめプログラムした急性期用の筋肉／局所循環の増加、低パルス設定が使用された。 この設定は、8Hzで90％オン、10％オフのパルス設定であり、レーザーダイオードは850nm、LEDは670nm、デフォルトは4J/cm2であった。 すべての治療スポットは、この記述されたスポットパターンで4J/cm2を受け、各治療中に2回、合計8J/cm2の治療投与量を受けた。 デジタル写真は、0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、21日目に撮影された。 非レーザー治療群は、レーザー治療を受けず、0、1、3、5、7、21日目に写真を撮られた。 研究終了後、すべての写真に、コンピュータで作成した4つの無整理番号リストを用いて、1から125までの番号がランダムに割り当てられた。 瘢痕尺度の犬の写真を白いコルクボードに並べ、0、1、2、3、4、5とラベル付けして瘢痕尺度を定義した。 ボードは0（0日目）、1（1日目）、2（3日目）、3（5日目）、4（7日目）のスコアを表し、21日目の写真まで直線的に間隔をあけ、5というスコアの傷跡スケールを表している。 治療群の写真は、無作為に割り当てられた画像番号に従って昇順に並べられた。

手術、患者のケア、レーザー治療、写真の取得に関与していない獣医ボランティアが、画像の採点に参加した（JW, EB, JB, RB, JG, LS）。 採点はすべて個人的に、同じ部屋で、日中に行われた。 すべてのボランティアは、切開部位の滲出、打撲、痂皮、炎症、浮腫、肉芽、上皮化、収縮、発毛を考慮し、美容的治癒に基づいて0から5までの整数値で画像を採点するように指示された。 各ボランティアは、すべての写真を1回で採点した。

変動要因の有意性および評価者間信頼性の検定は、統計解析システムのGLIMMIXプログラム5で行われた共変量解析を使って決定された。 治療法の統計的有意差の臨床的重要性は、信頼区間を用いて評価した(22)。 P値が< 0.05の場合、有意であるとした。 8742>

Results

この研究は、2010年9月から2012年5月までミシシッピ州立大学獣医学部動物健康センターで全面的に行われた。 この期間に12頭の犬が我々の包括的基準を満たし、3頭の傷跡スケール例犬、5頭の非レーザー犬、4頭のレーザー治療犬とされた。 シグナル、ボディコンディションスコア、切開の長さ、病変の位置、脂肪グラフトおよび/またはジェルフォームの使用、使用した縫合材料、ステロイド投与、および手術時の神経学的状態に、レーザー治療犬とレーザー治療でない犬の間に差はなかった。 レーザー治療犬はすべて茶色であったが、非レーザー治療群では黒色3頭、茶色2頭であった。 すべての犬が落ち着いており、写真撮影やレーザー治療も快適に行えたため、本研究を完了することができた。 退院時の神経学的状態は、全犬種とも変化なしまたは改善し、低下した犬はいなかった。 ほとんどの犬が手術時または紹介前にステロイド投与を受けた（67％）。 非レーザー犬（n=4）とレーザー犬（n=2）の一部にはステロイドが投与されていた。 ステロイドの種類、投与量、投与時期、頻度は研究集団内で異なっていた。

最初の3頭は何事もなく治癒し、均一に美容的に見え、瘢痕スケールスコアを作成するために選択された。 調査犬の瘢痕スケールスコアは、撮影日（p＜3263＞0.0001）、レーザー治療の有無（p＜3263＞0.001）と有意に関連したが、審査員によるものではない（p＝0.9）。 傷跡スケールの順位は、皮膚科医、放射線科医、実験動物専門医、一般開業医、外科医2名（JG、EB、LS、JB、RB、JW）からなる6名の獣医師審査員すべてにおいて同様であった。 0日目、1日目、3日目、5日目の瘢痕スケールスコアに、群間差はなかった。 レーザー治療とレーザー以外の犬では、7日目と21日目の瘢痕スコアに統計的に有意な改善がみられた（p < 0.0.1）。 7日目の平均瘢痕スコアは、レーザー治療（95％CI = 3.21-4.12）の方がレーザー治療でない犬（95％CI = 1.85-2.56）より有意に高かった。 21日目の平均瘢痕スコアは、レーザー（95% CI = 4.52-5.03）がレーザーでない（95% CI = 3.25-4.21）犬よりも有意に高かった（図2A-C）。 レーザー治療を受けた21日目の犬は、平均スコア4.78±0.54に対して、非レーザーの犬の平均3.73±1.34と、そのスコアにあまり変動がなかった（図3）

Figure 2. 21日目における2つの治療群の代表画像。 (A）切開の上皮のいくつかの上にかさぶたの継続的な存在を示す、非レーザー患者。 (B)切開部の右側に広い瘢痕領域とピンク色の肉芽が1つ残っている非レーザー患者。 (C) 切開部の周囲と切開部に収縮と発毛を伴う完全に治癒したレーザー治療患者

21日目の結果は、6人のレビュアーを使用して8人についてレーザー治療および非レーザー群についてさらに比較された。 1頭のレーザー治療犬は、21日目の写真撮影に戻らなかった。 レーザー治療に関わらずステロイド治療を受けた犬は、21日目にステロイド治療を受けなかった犬（平均5±0.0）に対して、臨床的に有意に低い傷跡スコア（95％CI 3.41-4.25）を有していた。 ステロイドを投与された犬は、レーザー治療を受けなかった群（95％CI = 2.89-3.94）と比較して、レーザー治療も受けた群（95％CI = 4.30-5.32）の方が21日目に平均傷跡スコアが高くなりました。 しかし、ステロイドとレーザー治療を受けた2頭の犬は、21日目の時点で中央値5点、平均値4.8点であった。 ステロイドを投与され、レーザー治療を受けなかった犬は、21日目の瘢痕スケールで1～3点低かった。

5日目までの平均スコアは、レーザー群の瘢痕スケールスコアで1点高く、21日目まで平均1点高くなり続けていた。 標準偏差(SD)は、21日目のレーザー群のSDが0.35であった以外は、すべてのスコアで0.85から1.6であり、審査員間の強い一致を示した(表1)。 中央値は、3日目からレーザー治療群で等しく上昇し、試験終了まで継続した。 レーザー治療群の0、1、3、5、7、21日目のスコアの中央値は、それぞれ1、2、2.5、3、4、5であった。 0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、21日目における非レーザー群の瘢痕スコアの中央値は、それぞれ1、2、2、2.5、4であった。 全体として、この研究ではレーザー治療による瘢痕スケールスコアに強い予測値があった（図4）。 Spearmanの相関係数は、瘢痕スコアと審査日において統計的に有意であった（rs = 0.80）。 評価者間の一致を比較するカッパ値を各日ごとに示す（表2）。

Table 2. 瘢痕スコアの評価者間一致のための自由限界カッパ

考察

レーザー治療は、おそらく酸化的リン酸化を刺激することにより創傷治癒を促進することが分かっており、したがって炎症反応と痛みを軽減する（6、8-10）。 本研究は、IVDDの犬の半月板切除術を行った際に、レーザー治療により外科的切開部が改善されたことを示すことにより、レーザー治療により誘発されるPBMが創傷治癒とリハビリテーションに不可欠な要素であるという考えをさらに支持するものである。

5人の異なる専門の獣医師と一般開業医を募集し、切開部位の滲出、打撲、痂皮、炎症、浮腫、肉芽、上皮化、収縮、発毛を見ることによって、全体の美容的外観を順位づける同じ指示を与えた。 他の研究では、組織学的証拠を用いずに創傷治癒を評価する能力も評価されており、デジタル写真を用いた臨床的瘢痕スケールなど、死亡前調査に適応される成功した様式が見出されている（3, 18, 21）。 特定の治療法による創傷治癒の効果を評価する有効な手段としてデジタル写真を使用することは、患者の肉眼的評価が可能で、組織学的な確認が必要ないため、特に価値がある（3, 21）。 この評価方法は、ブタの熱傷瘢痕、ヒトの皮膚移植、さらに最近のイヌのレーザー研究などを用いて、より具体的に検討されてきた（18、23、24）。 これらの研究により、創傷治癒の組織学的特性と瘢痕の臨床的転帰の視覚的評価との間に相関性があることが確認された。 この研究とGammelら(23)の研究から得られた情報は、デジタル写真を用いて信頼性の高い臨床的瘢痕スケールを確立することが可能であることを証明するものである(23)。 したがって、この高いレベルの相関は、レーザー治療によって引き起こされるPBMのような補助的な治療で処理された外科的に作成された創傷を分析する際に使用できる方法であることを示す。 7日目以降、評価者間の一致率が大きく上昇し、特に21日目のレーザー群では評価者間の相関が優れていた（κ0.79）。 瘢痕スコアのばらつきは治癒とともに改善されたが、レーザー群のスコアのばらつきは研究期間を通じて小さく、研究期間を通じてスケールの数値が高かった。 このことは、21日目の優れたカッパ値と相まって、基準瘢痕が写真上で臨床的治癒を評価するための信頼できる方法である可能性を示している。 しかし、瘢痕のスケールスコアに慣れ、写真のスコアリングを繰り返すことで、より高い一致が見られた(18)。 Wangらは、写真の評価を繰り返すだけで、相関係数が65％から80％以上まで上昇することを示した。 おそらく、レビュアーが同じ画像を何度も採点することで、より早い段階で結果の一致が得られたのだろう。

IVDD患者へのステロイド投与は、獣医師の間で論争が続いている。 今回のプロスペクティブスタディでは、ステロイドの種類、投与量、投与期間はコントロールされていないため、結論を出すことはできなかった。 また、周術期の大量ステロイド投与は、慢性的な使用と比較して、創傷治癒に統計的に影響を与えないと考えられていることにも注意が必要である(25)。 ヒトで10日以上ステロイドを使用した場合、創傷合併症の発生率は2～5倍になるが、合併症、投与量、手術によって異なる(25)。 また、脊髄に直接レーザーを照射することは禁忌であるという根拠のない懸念から、半月板切除部位に直接レーザーを照射することは避けた。 この潜在的な懸念は文献上では反論されており、神経学的転帰を改善することが示されている(4)。 我々の結果と合わせると、これら2つの研究は、術後1週間は毎日8J/cm2を照射することでIVDDの犬の外科的治癒が促進されることを示唆している。

我々の研究では、犬の慢性創の症例報告（5J/cm2）、創傷治癒（5J/cm2）、開放創（1J/cm2）に以前に報告された量よりも高い量が用いられた（12、23、26）。 また、以前の研究では4日または5日間治療し、この研究では連続7日間行ったことに注意すべきである(4, 12)。 追加の研究では、1J/cm2を用いた週3回、32日間の治療では、PBMに明らかな効果は見られなかった(26)。 このことは、より高い線量とおそらくより集中的な治療スケジュールが、PBMに対してより成功する可能性があることを示唆している。

一日おきのレーザー治療、J/cm2の多寡、治療日数の少なさで所見が変わるかもしれないが、犬の表皮角化細胞は10J/cm2で有害な影響を示した(27)。 創傷治癒の文献上の範囲は1-40J/cm2であるので、我々は中間の範囲を選んだが、それでも効果が見られる可能性を高め、かつ組織損傷を避けるために積極的な投与量とした。 最近、世界レーザー治療学会は、細胞の変化を引き起こすには少なくとも5-7J/cm2が必要であると指摘し、これは治療量の下限であることを示唆している(28)。 このことは、イヌの1J/cm2または5J/cm2を用いたPBMに明らかな効果がないことを示した最近の2つの創傷治癒研究によって、潜在的に確認されている（23、26）。 我々の研究では、患者の多くは7日間の治療が完了する前に帰宅する準備ができていた。 したがって、レーザー治療の成功は、入院を継続するか、患者が毎日の外来治療のために戻ってくるか、クライアントのコストと比較検討される必要があるであろう。 レーザー治療をしていない犬は、21日目の時点で切開部や橋渡し上皮に毛が生えておらず、瘢痕がより広く、より多くの痂皮がまだ存在しているように見えた。 おそらく、最終的には両群とも、さらに時間が経てば同じように見えるようになるのだろう。 本研究は、21日以上経過した患者を追跡調査していないため、これは不明である。

本研究は、より一貫した手術痕のためにIVDD患者に焦点を当てているが、おそらく本研究は、他の犬の外科的切開または傷に対するPBM治療を含めるために外挿することが可能である。 創傷治癒の炎症期にある同様の創傷は、理論的には本研究と同様に良好な反応を示すはずである。 しかし、これらは複雑でなく、清潔な外科的切開であり、開放創ではないので、これらの結論を導き出すことはできない。

この研究の大きな限界は、サンプルサイズが小さいことですが、グループ間の差が大きいため、臨床的に有意であると思われる統計値が見出されたことです。 しかし、サンプルサイズの関係で、痛み、ステロイドの使用、神経機能、代謝変数など、他の興味深い変数については結論を出すことができなかった。 これは、外科的切開のためのデジタル写真と瘢痕スケールスコアを使用した最初の獣医学的研究である。 審査員は治療群に盲検化され、写真は、ダップルカラーリング、背中の過去の手術、切開部や皮膚へのトリミングを除外し、患者の特定を防ぐために一様に撮影された。 しかし、写真はカラー画像であり、切開部や軸筋の長さは一様ではなかった。 そのため、審査員は治療群には盲検化されていましたが、ランダムに番号付けされた画像を見ながら、切開の形や背骨のカーブを認識して採点していたかもしれません。 そのため、患者さんの切開部分の治癒傾向に気づいたかもしれませんが、彼らは治療グループに対して盲検化されていました。 傷の瘢痕化を最小限に抑えたより完全な治癒は、全体の引張強度と非常に強く協調することが示されている(3, 10, 18, 21, 23, 26)。 非侵襲的な創傷治癒スコアリングシステムには明らかな利点がある。 2群間の創傷治癒の引張強度の真のテストはより決定的であったろうが、査読者間の強い一致は、これらの動物が連続生検という付加的な病的状態を必要としなかったことを示すものである。 この研究では、各患者のPBMの総時間を記録していない。 投与量はあらかじめ決められており、切開を包含する治療部位も決められていたが、切開の大きさと患者は異なっていた。したがって、総ジュールと治療時間は変化した。 今後の研究において、これは記録すべき貴重な情報となる可能性があり、PBM研究の報告および比較の統一に役立つと思われる。 その他の研究の限界は、異常な創傷治癒に対する既知の危険因子である多くのもの、および手術に関連する因子（すなわち、スクラブの詳細、中核体温、手術時間）について結論を出すことができないことであった＜8742＞＜8005＞結論＜7750＞＜2309＞これら4頭の犬の外科切開は、7日間毎日8J/cm2のレーザー療法により誘発されたPBMによってより速く、より美容的に治癒された。

Authors Contributions

JW, KG, and AWは研究の構想およびデザインに貢献した。 AWはデータベースの整理を行った。 JW, EB, JB, RB, JG, LSは写真の解析と患者の採点を行った。 KGはこのプロジェクトの助成金申請書を作成した。 JWはこの原稿の原案を執筆した。 原稿の修正にはすべての著者が参加し、提出された原稿を読み、承認した。 投稿時、査読時、出版時のジャーナルおよび編集部とのコミュニケーションは、corresponding authorが主な責任を負う。 また、責任著者は、投稿原稿が著者資格、研究倫理、倫理承認、臨床試験登録書類、利益相反申告を含む（ただしこれらに限定されない）すべてのジャーナル要件に準拠していることを確認する責任がある。 また、対応する著者は、出版後も問い合わせや批評に対応できるようにしておく必要があります。

Conflict of Interest Statement

著者は、本研究が潜在的な利益相反と解釈される商業または金銭的関係のない状態で行われたことを宣言しています。

謝辞

統計解析を行ったDr. Dennis E. Roweの助力に感謝する。

一部、ミシシッピー州立大学獣医学部研究大学院の支援を受けている。

脚注

略語

PBM, Photobiomodulation; IVDD, Intervertebral Disc Disease.

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