Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach

マーカーを正確に評価するには、カビの識別に熟練することが必要です。 結果は培養によって確認する必要があります。

形態学的特徴の認識

アスペルギルスは自然界に遍在しているため、検体や培地を汚染することが一般的です。 そのため、検体の顕微鏡検査が陰性の場合、培養で増殖するアスペルギルス属菌の重要性を判断することはしばしば困難である。 Brown らは、肝臓および腎臓移植患者から分離されたアスペルギルス属菌の調査において、培養液中に 2 個以上のコロニーが存在し、2 箇所以上に感染がある場合、重大な感染が予測されることを発見した。 急性白血病の顆粒球減少症患者では、下気道検体からの1回の分離を重要視する必要がある。 検査結果を医師に明確に報告することで、診断上のジレンマが解消されることがある。 例えば、「A total of three colonies of Aspergillus fumigatus isolated on two of three plates」という記述は、「Rare A. fumigatus isolated」よりも多くの情報を提供する。

Optimizing results of culture

Isolation in culture and phenotypic identification of common clinical isolates of Aspergillus spp.は通常迅速かつ容易である。 しかし、培養は時間がかかると言われることが多く、おそらくアスペルギルス菌の検出に対する価値について誤解を生んでいる。 A. fumigatus は急速に増殖する菌です。 典型的なベルタン状の灰青緑色のコロニーと単芽球状の分生子頭部は、真菌培地と細菌培養によく使われる羊血液寒天培地の両方で24～48時間以内に発育する。 侵襲性アスペルギルス症に関連する他のアスペルギルス、特にA. flavus, A. niger, A. nidulans, A. terreusは、25℃および37℃で7日間培養後、麦芽エキス寒天培地およびCzapek酵母培地でコロニーの成長を測定するとA. fumigatusと同様の成長速度を示している 。 アスペルギルス属菌の中には薬剤耐性菌が存在するため，A. fumigatusだけでなく，あまり分離されない種についても完全な同定が必要である． 最近、いくつかの抗真菌薬に対して感受性の低い胞子形成不良（白色）株が報告されている。 これらの白色株は，野生型のA. fumigatus Freseniusとは遺伝子配列が異なり，培養後10〜12日目まで典型的な青緑色の分生子頭部が形成されない。 また、白カビであるNeosartorya fisheriは、当初A. fumigatusに似たまばらな分生子頭を発生させるという課題もある。 しかし、N. fisheriはその後、丸くて薄い壁の子嚢を多数発生させるので、A. fumigatusとの区別が簡単になります。 分生子頭部と分裂組織の位置をすばやく確認するために、解剖スコープが便利である。 A. fumigatus の分離株には、無菌で白色、生育の早いものや、glabrous、mounded、生育の遅いものがあり、確定診断には耐熱試験やエキソアンチゲン試験が必要である . Khan らは、非典型的な A. fumigatus を報告している。 アスペルギローマ患者の下気道検体から分離されたterreusである。 初期コロニーは橙色で，拡散性の黄色色素とScedosporium apiospermumの分生子と混同される小型の単細胞を産生した． 1055>

教科書やインターネットに掲載されている画像や情報は、アスペルギルス属の同定を学ぶための素晴らしい教育機会である。 しかし、実地体験が最も効果的な教育手段であることに変わりはない。 CDC、National Laboratory Training Network (NLTN)、CBSはラボラトリー・ワークショップを開催している。 出張が現実的でない場合、検査室はオンラインチュートリアル、Aspergillus Reference Cultures を社内トレーニングに利用することが推奨される。

培養手順の各ステップを分析することで、アスペルギルス菌の回収率を向上させることができる。 内視鏡手術で回収した喀痰や副鼻腔の粘液に含まれる真菌の回収には、Sputolysinや他の粘液溶解剤で検体を液化することが示唆されている。 Aspergillus属の一次分離培地として、Pato dextrose, potato flake, malt extract, inhibitory mold agar, or similar sporulation agarを使用すると、増殖速度や分生子産生が速くなることがある。 抗菌剤の添加は、細菌の過繁殖を抑制し、下培養の必要性を低減することにより、同定までの時間を短縮するのに役立つ。 真菌用培地を30℃の代わりに、あるいはそれに加えて35～37℃で初期培養すると、一部のアスペルギルス菌の生育を早めることができる。 同様に、毎日培地を検査することで、可能な限り早い段階で発見することができる。 Tarrandは、培養プレートを35℃の微好気環境で培養することにより、臨床的に重要なアスペルギルス属菌が12個のブロス培養のうち12個から増殖することを見いだした。 同じ生物をCO2なしの25℃で培養したところ、陽性結果は得られなかった。 臨床的に重要なアスペルギルス属菌の回収と迅速な同定に最も有効な培地と条件を明らかにするために、さらなる研究が望まれる。

スコッチテープやティースマウントで、アスペルギルス属の分生子頭部は通常同定することが可能である。 しかし、胞子形成が遅い場合や非典型的な場合には、スライド培養が必要な場合がある。 病院の検査室では、迅速な検査が要求されるため、スライド培養は最も簡単な方法であるが、必ずしも最も洗練された方法とはいえない。 Riddellの古典的なスライド培養法は、より労力のかからない他の手法で補完されてきた。 手軽な方法は、18×18mmのカバースリップを45度の角度でポテトフレーク寒天のような胞子培地に押し込むだけである。 カビが胞子形成したら、カバースリップを寒天から慎重に引き抜き、顕微鏡用スライドにラクトフェノールブルーまたはラクトフクシンを滴下してマウントする。 1055>

Workforce issues

アスペルギルス症の迅速な診断は、改善された方法論だけでなく、適切でよく訓練された労働力にも依存している。 真菌学の診療所に関する調査では、より多くのトレーニングを行うことが強く推奨されている。 特に、正確な同定、直接検査、培地の適切な使用、臨床的妥当性、費用対効果に重点を置くべきである。 しかし、不十分な人員配置は、トレーニングやより臨床的に適切な処置の実施に支障をきたす可能性がある。 ASMベンチマーク調査により、米国の一部の微生物検査室では人材不足が続いていることが明らかになった。 この不足は、過去12年間にCLSトレーニングプログラムが53％～56％減少したことが一因である。 現在、微生物検査室で働く専門家の34%は50歳以上である。 彼らが退職したとき、その代わりとなる若い労働者はいるのだろうか？ 労働力人口の約80％が30歳未満の女性であるのに対し、微生物検査室で働く女性労働者のうち30歳未満はわずか10％である。 1055>

Conclusion

真菌症の従来の診断方法と非伝統的な診断方法の両方を改善するには、十分な労働力を確保し、キャリアモビリティ、専門的認識、上級訓練の機会、報酬、その他実験科学への関心を刺激するために必要な要素を改善するための努力が同時に必要である。

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