受容体の予測性能に対するヒスチジンプロトン化とロータマー状態の効果を評価するために、我々は以前のハイスループットスクリーニング（HTS）の研究結果に基づいてMtb酵素RmlCのバーチャルスクリーニング（VS）を実行した。 以下では、まず共結晶リガンドTRHの典型的な相互作用を調べ、ヒスチジンのプロトン化に対するリガンドのポーズ依存性を探る。 さらに、受容体との相互作用について考察し、異なるヒスチジンプロトン化状態がVSに及ぼす影響を示すことで、様々な受容体モデルの濃縮性能と予測力の解析を文脈化する。 770>
Docking of TRH
Docking of the co-crystal ligand TRH into 36 receptor models back to the pose, or ligand orientation relative to the receptor, dependence on histidine protonation and rotameric states.最後に、いくつかの一般的なpKa計算パッケージで計算した予測pKa値と最も予測能力の高い受容体プロトン化状態を比較した。 図2bに示すHis62とHis119の結晶座標の化学的に直感的な水素結合パターンは、TRHのドッキングにおいて水素結合が重要である可能性を示唆している。
ヒスチジンのプロトン化状態を変化させると、決定した共結晶リガンドのポーズ予測に明確な影響を与える。 ヒスチジン62とヒス119のプロトン化状態やロータマー化状態を変えた場合のTRHの結晶座標へのドッキングポーズのRMSDは2.91から5.44Åの幅があり，最も平均RMSDが高かったのはHIEで，これはTRHの結晶座標の最も確率の高いプロトン化状態に一致するものだった． また、すべてのケースで、ドッキングアルゴリズムはリガンドのピロリン酸の位置を正しく予測していますが、結晶座標からの大きな偏差は、主にピロリン酸の周りでチミジンおよびラムノース部位が反転し、TRHと二つのヒスチジン間の異なる水素結合パターンに起因しています。 このことは、共結晶リガンドTRHの姿勢予測において、His62とHis119との水素結合ネットワークが重要であることを示しています。 そこで、2つのヒスチジンの水素結合によるポーズ依存性を調べた後、VSにおける化合物のランキングと、それがヒスチジンのプロトン化およびロータマー化の状態にどのように影響するかを系統的に調べるために、研究を拡張しました。 リガンドセットは、HTSからランダムに選ばれた10個の活性体と2,000個の不活性体から構成されていた。 谷本スコアは、ほとんどのデコイが活性化合物と低い類似性を持っていることを示している。 このようなデコイセットは、ドッキングアルゴリズムにとって小さな挑戦であり、活性物質との類似性が高いデコイを使用した場合、VS自体の予測性能に影響を与える可能性がある。 しかし、この研究では、ドッキング・アルゴリズム自体の予測性能ではなく、ヒスチジンのプロトン化状態がVSの相対性能にどのように影響するかを調べることを目的としました。 すべての受容体モデルにおいて、疎水性のπ-πスタッキング相互作用は、RmlC活性部位内の活性化合物のドッキングスコアに大きく寄与している。 HTS による最初のヒット化合物である SID7975595 は、ほとんどの受容体モデルで上位にランクされており、36 受容体のうち 26 受容体で 8 位から 51 位の間であることがわかった。 SID7975595 と共結晶リガンドである TRH との構造的類似性はわずかであるが，SID7975595 の三環式環は TRH のチミジン部分を，ベンズイミダゾロン環はラムノース部分を容易に置換し，阻害の構造基盤を提供した。 図3に示すように、作用物質と受容体の間の疎水性相互作用には、しばしば鎖AのTyr132とTyr138、鎖BのPhe26が関与する（鎖Aの活性部位に鎖Bの一部が入り込んでいることに注意されたい）。 このような結合部位に必須な残基と相互作用し、水分子がPhe26とTyr132にアクセスするのを防ぐことで、活性物質は高い結合親和性を達成するために豊富な疎水性接触を提供する。 Sivendranらで議論されているように、SID7975595の三環上の窒素に結合したエチル基をアリル基で置換すると（例えば、活性化合物77074）、さらに緊密な疎水性シールを形成して結合親和性を高めることができる。 これに対して、この基をより小さなメチル基または水素原子で置換すると、結合親和性は低くなる . 上記の疎水性接触に加えて、いくつかの活性体はSer51、Arg59、Arg170と水素結合を形成する。 ドッキングされた活性剤の相互作用を説明する図は、Online Resource 3に掲載されている。 一般に活性物質はHis62やHis119と強い相互作用を持たないが，ヒスチジンのプロトン化状態を変化させると，ランク付けの結果に大きな影響を与えることがわかった。 ここに描かれているように、Tyr132およびTyr138などの他の結合部位残基と有利な相互作用が観察される
興味深いことに、作用物質は一般にHis62およびHis119と極性相互作用を達成しない。 図3に示すように、SID7975595のカルボニル酸素および2つのベンズイミダゾロンニトロゲンは、His62およびHis119から離れる方向に面している。 活性体の芳香族水素の向きは、2つのヒスチジンとの水素結合ネットワークに参加できないことが多い。 しかし、これらのヒスチジンのプロトン化およびロータマー化状態の違いは、デコイとの相互作用を通じてVSの結果に影響を与える
ランキングの違いの評価
VS研究では、限られた資源のためにスクリーニングされた化合物の上位1％しか実験的にテストできないことが少なくない。 したがって、ライブラリの上位1 %（20個のドッキング化合物）におけるデータベースの濃縮性能を反映する濃縮係数（EF）1%という指標は、VSの予測力を評価する上で特に重要になる。 36の受容体モデルでEF1%は0から80の範囲にあり（表1）、RmlCのHis62とHis119のプロトン化およびロータマー化の状態にVSの結果が敏感であることが示されました。 しかしながら、36の受容体のうち28の受容体は、EF10%に反映されるように、VSにおいて上位10%以内に8つ以上の活性物質をランク付けしており（表1）、データベースの大きな部分（10%）を考慮すると、ほとんどの受容体が活性物質とデコイを区別できることが示唆されました。 また、EFの結果から、HIP62やHIP119を持つ受容体モデルは、後述するようにデコイとの広範な水素結合ネットワークが原因で、濃縮性能が低い傾向があることが示唆された
His62とHis119のプロトン化およびロータマー化状態を変えたときのモデルの濃縮性能を報告するために、それぞれの受容体モデルの受信者動作特性曲線下の面積（AUC）が評価された。 図4aおよび表1に示すように、すべての受容体モデルのAUC値は0.868から0.996の範囲で、全体的に良好な予測性能を示している（AUC 0.5は活性体とデコイを区別しないことに相当する）。 一般に、AUCの結果は、受容体予測性能のEF評価を補完するものである。 表1を要約すると、図4cは、受容体性能の範囲が、2つのヒスチジンのプロトン化およびロータマー化状態にどのように依存するかを示しています。 AUCの25～75 %の範囲（Fig. 4c、太線で示す）を考慮すると、His62モデルはHis119状態間でより大きな変動を示しています。 一方、His119モデルは、HIP状態を除いて、His62のプロトン化状態に関わらず、より安定した性能を示している。 770>
a 36種類の受容体モデルのAUC値。 各ヒスチジンのプロトン化状態、ロータマー化状態をマークしている。 濃い色はAUCが高く、対応する受容体モデルの予測性能が高いことを示している。 各ヒスチジンについて、プロトン化状態とロータマー化状態をマークしています。 明るい色は水素結合率が高いことを示し、カラーバーの単位は％である。 各 VS run の AUC と平均水素結合率の相関の R2 は 0.42 である（散布図は Online Resource 4 参照）。 c His62（上）および His119（下）の受容体性能依存性。 各プロトン化状態のAUC値の中央値を大きな横線で示す。 各ヒスチジンモデルの小さな目印は、もう一方のヒスチジンの6種類のプロトン化状態を示しています。 太い縦線は、AUCの25-75 %の範囲を表しています。 最良の受容体モデルは、モデルのプロトン化状態
His119のプロトン化状態に対する濃縮度の強い依存性が、HIE62およびHIP62モデルで観察される。 HIE62の状態では、反転したHIP119（モデル6）と反転したHIE119（モデル2）を持つモデルが、最も高い受容体性能をもたらす。 HID119とHIP119をそれぞれ用いたモデル3と5は、最悪のエンリッチメントをもたらす。 なぜHIE62の状態が最も大きなAUCの変動を示すのかを検討すると、His62はリガンドとπ-πスタッキングをするか、全く相互作用せず、高ランクのデコイとわずかな水素結合を作るだけであることがわかった。 したがって、受容体の性能はHis119とデコイとの相互作用に依存する。 このことは、HIP62モデルのAUCの性能範囲が広いことを調べてもわかる。 また、デコイとの水素結合ネットワークについては後述する。
受容体モデルのペア間のAUC値の差の統計的有意性を評価するために、ペアが統計的に同等のAUC値を持っているという帰無仮説と、AUC値および予測力の差が統計的に有意であるという対立仮説に対して95%水準で両側p検定を実施した。 その結果をOnline Resource Table 1に示し、0.05未満のp値を強調した。 平均して、受容体は16以上のp値が0.05未満であり、ヒスチジンのプロトン化とロータマー状態に対するVSの感度を実証しています。 予想されるように、最も有意差のあるレセプターは、最も高いAUC値（モデル6）または最も低いAUC値（モデル3、29、5）を持つモデルに対応しています。 モデル6は、アンサンブル内の他の26の受容体よりも、デコイに対する活性物質の順位付けにおいて統計的に優れています。 モデル3、29、5は、それぞれ29、25、31の他の受容体よりも活性物質の順位付けが際立って悪い。
水素結合相互作用の定量分析は、デコイでしばしば観察される結合部位残基との豊富な水素結合相互作用を考慮し、各VS結果の上位1 %（20化合物）について実施された。 その結果、水素結合の寄与と受容体の性能の間に逆相関があることがわかった。 図 4b は、上位 1 %のドッキング化合物について、各受容 体モデルの平均水素結合率を示している。 水素結合率は、ドッキングスコア全体に占める Glide XP の水素結合項の割合として定義される。 Fig. 4a, b を比較すると、水素結合率と AUC の間に逆相関が認められ、R2 は 0.42 である（y = -56.18x + 67.95, その相関は Online Resource 4 にプロットされている）。 この逆相関は、HIP119、flipped HIP119、HID62 を持つモデルでよく見られ、水素結合率が高いために濃縮率が悪くなっていることがわかる。 例えば、HIP62とHIP119を持つ受容体モデル29は、両方のヒスチジンが活性部位に面した水素結合供与体を提示しているが、トップヒットにおける水素結合の割合が高く、最悪のAUCの一つである。
特に、His119の水素結合能が受容体の性能を決めることが多い。 例えば、図4cのHID62とHIP119を用いたモデルはHID62モデルの中でも異常値であり、他の5つのHID62モデルの性能が全体的に良いのに比べて、明らかに低い濃縮度であった。 HID62 モデルでは、HID62 からのデコイへの水素結合が頻 繁に見られるにもかかわらず、AUC の中央値は 0.989 と高 い値を示している。 これは、His119状態がデコイとの水素結合相互作用をほとんど達成していないためである。 HIP119状態でのみ、HID62モデルは多くのデコイと水素結合を行い、その結果、比較的低いAUCとなった。 この結果は、上述したHis119のプロトン化状態に対する受容体性能の強い依存性と一致する。 770>
上記の解析により、プロトン化状態やロータマー状態が異なる2つのヒスチジンの様々な座標が原因で、デコイへの水素結合がVSの予測力を阻害する効果があることが浮き彫りになった。 また、R2が0.42とばらつきがあるのは、デコイデータセットの化学的性質や、タンパク質の初期準備で最小化する際に各受容体の形状がわずかに異なることなどが原因である可能性があります。 このように、活性部位のヒスチジンのプロトン化状態やロータマー化状態の違いによる仮想スクリーニング結果の感度を明確に示すことで、特にスクリーニング対象のリガンドの一般特性を考慮して、VS用の受容体の原子座標を準備する際に注意すべきことを強調しています。 これには、共結晶リガンドへの水素結合とタンパク質調製への影響を考慮すること、および近接した水素結合ネットワークの包括的な分析が含まれる。 これは通常、広く使用されている pKa 予測ソフトウェア パッケージからの結果を調べることによって達成され、この時点まで、私たちの VS の結果に対して異なるパッケージからの結果を比較し、さらに議論しました。
Docking of the decoys
さまざまな要因が、特にデコイに関する、受容体全体でのランキングの違いにつながります。 一般に、活性体よりも上位に位置するデコイは、分子量が大きく、受容体と水素結合を持つ可能性が高いことがわかった。 ここでは、濃縮度の低い受容体モデルを中心に、デコイと受容体の間で観測される頻度の高い相互作用パターンをさらに分析する。
デコイは活性体よりも分子量が大きく、環状構造が多い傾向がある（表2）。 この結果、受容体との水素結合がない場合、疎水性相互作用により、デコイが上位にランクされる。 図5aは、受容体モデル19の大きな不活性化合物16952387によって達成された疎水性相互作用を示したものである。 この化合物は、Phe26、Tyr132、およびTyr138との実質的なπ-πスタッキング相互作用により、多くのVS実行で上位5位以内にランク付けされることが多い。 このような傾向は、仮想スクリーニングにおいて、受容体との広範な相互作用の結果として、より大きな分子が上位にランクされる場合によく見られます。
a 非活性体の16952387と受容体モデル19におけるフリップHID62、HIE119の相互関係。 この化合物はいずれのヒスチジンとも相互作用がない。 B鎖のPhe26，Tyr132，Tyr138とのPi-Piスタッキング相互作用が，Arg23，Arg59，Arg170，Ser51（図示せず）との水素結合とともに，その高いランクに寄与している。 b受容体モデル3における不活性化合物17388064のHIE62，HID119との相互作用． 両ヒスチジンは化合物に水素結合を提供する
デコイに豊富な水素結合ネットワークを提供する受容体の濃縮性能は特に低い。 His62とHis119を介した相互作用は活性体ではあまり観察されなかったため、エンタルピー寄与の大きい化合物が誤って有利にランク付けされている。 Fig. 5b に示す例は、受容体モデル 3（AUC0.868）における不活性化合物 17388064 の相互作用を 1 位にランク付けしたものである。 AUCに基づく化合物のランク付けが最も悪いこの受容体では、化合物17388064は、2つのヒスチジンと2つの水素結合を形成し、1つはその水酸基水素とHIE62のδ-窒素との間、もう1つはその水酸基酸素とHID119のδ-窒素上の水素との間である。 この化合物の水素結合供与体は5個、受容体は9個であり、デコイと活性体のそれぞれの平均値と比較して多い（表2）。 このため、水素結合の寄与が34.7 ± 6.62 %と高く、このデコイ化合物は2つのヒスチジンのいずれかと少なくとも1つの水素結合を形成することが頻繁に観察され、複数のVS実行で高ランクを獲得した。
他の二つの受容体モデル、HIP62とHIP119によるモデル29、HIE62とHIP119によるモデル5もモデル3同様のデコイへの相互作用パターンを示している。 この3つのモデルはAUC値が最も低く、その平均は0.870であった。 上述したように、彼らのAUC値は他の受容体と大きく異なっており、His62とHis119を介して達成される水素結合と貧弱な濃縮との間の微妙な関係を反映している。 770>
pKa prediction for His62 and His119
我々の結果は、ヒスチジンのプロトン化およびロータマー状態に関する仮想スクリーニングの感度を明確に示している。 多くの計算生物物理学的研究において、滴定残基のプロトン化状態は様々なpKa予測プログラムを使って決定される。 ドッキングにおいて最も予測力の高い受容体モデルを同定するためのこれらのプログラムの性能を評価するために，表3に示すようにPROPKA，Maestro，H++，MCCEによるHis62とHis119のpKa予測結果と計算値を比較した．
最初に、PROPKA 3.1 は、調製時のTRHの存在にかかわらず、His62、His119ともに中立と予測した。 しかし、このプログラムはヒスチジンのロータマー状態を割り当てることができない。 したがって、HID、flipped HID、HIE、flipped HIEのいずれかの状態を手動で決定する必要があります。 PROPKAと同様に、単一構造の連続体静電気力学を用いたプログラムH++も、予測されるpKa値はPROPKAのものとは異なるものの、両方のヒスチジンが中性であることを発見しました。 770>
次に、MaestroのProtein Preparation Wizardを用い、TRHの有無によるHis62とHis119のpKaを算出した。 PROPKAができないのに対して、Maestroはロータマー状態を変化させることができることに注意してください。 最近のアップデートにより、MaestroはpKaの予測にEpikの代わりにPROPKAを使用できるようになりました。 Epikでは、TRHの存在に関係なく、His62とHis119の両方が二重プロトン化された状態で予測されます。 興味深いことに、このマルチヒスチジン状態に対応する受容体モデルは、AUCが0.869と最も予測力が低い。 PROPKAを用いた場合、タンパク質-TRH複合体ではHIP62とHIE119が、アポタンパク質ではHIE62とHIE119が予測される。 MaestroのPROPKAによるこれら2つの予測は、モデル25（HIP62とHIE119）のAUCが0.971、モデル1（HIE62とHIE119）が0.942と、中程度の濃縮性能を持つモデルに相当する
異なるソフトウェアによる上記の予測は互いに大きく異なることから、この結果を仮想スクリーニング用のタンパク質を準備するガイドラインとして用いる際には注意が必要である。 スクリーニングするリガンドだけでなく、受容体の真のプロトン化状態を熟知していなければ、この問題に対処することは困難である。 したがって、本研究で行ったような小規模な解析と、もしあれば実験データとの比較により、将来の大規模なスクリーニングのために、タンパク質受容体の滴定残基のプロトン化およびロータマー化状態をより正確に記述することができることを提案します。 あるいは、Glideの回転可能なヒドロキシルやチオールのように、グリッドに情報を保存して、ドッキング中に代替の側鎖プロトン化および回転体の状態を明示的に組み込むモデルも、追求する価値があるかもしれません。 770>
さらに、受容体の柔軟性は、イオン化可能な残基のプロトン化状態に影響すると思われる。 この点については、ここでは明示的に調査していませんが、プロトン化状態を割り当てた後の各受容体の最小化は別として、タンパク質の柔軟性は、薬剤設計および開発にとって明らかに重要です。 コンフォーメーション空間とプロトン化空間を同時に考慮することは、ここで述べたような物理的な方法ではすぐに困難になってしまいますが、拡張サンプリング法はこのような困難に取り組む上で有望な方法です。 これには、 pH を外部の熱力学的変数とする定 pH 分子動力学シミュレーションが含まれ、滴定残基の pKa 値のブラインド予測に使用されます。 このようなシミュレーションの結果を分子設計に効果的に応用することは、現在最も注目されている分野である。 このようなシミュレーションから得られた平衡アンサンブルは、ドッキングと併用して、プロトン化された異なる構造のアンサンブルで仮想スクリーニングを行い、濃縮結果を向上させるという、緩和複合スキームの応用として使用できます。 受容体の柔軟性を考慮したターゲット調製は、コンフォメーションとプロトン化空間の幅広いサンプリングにつながり、VSの性能を向上させることができます。