1 Introduction
tRNAのフォールディングと安定性は効率的な翻訳に不可欠であり、どちらの特性にも欠陥があるとtRNAの量が減り、酵母の成長障害やヒトでの疾病につながる (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010)． 酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、欠陥のあるtRNA種を分解する2つの主要な細胞品質管理経路が知られている。 第1の経路は核監視経路であり、核エキソソームとTRAMP複合体を用いて核内のプレtRNAに作用する（Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005）、m1A58修飾を欠くプレ-tRNAiMetや3′トレーラーの加工を誤ったプレ-tRNA（Ozanickら、2009）、一部の野生型（WT）プレ-tRNA（Gudipatiら、2012）を分解することによって行われる。 第二の経路は、RTD（rapid tRNA decay）経路であり、5′-3′エクソヌクレアーゼRat1とXrn1の活性によって特定の成熟、低修飾、不安定なtRNA種を分解する（Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008）。 RTDは、tRNA本体のいくつかの修飾のいずれかを欠いた変異体や不安定化変異によって誘発され、同定されたすべてのRTD基質について、MET22欠失はtRNAレベルおよび成長を完全に回復させる（Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011)のように、様々な種類の基質が存在する。 met22Δ株におけるRTDの抑制は、Met22が阻害されるとレベルが上昇する代謝物3′-phosphoadenosine-5′-phosphateによるexonuclease Rat1およびXrn1の阻害によるものと推定されている（Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996）。
RTDはいくつかの特定のtRNAに作用することが知られており、7つのアプローチで同定・研究されている（図1）。 最初のアプローチは、マイクロアレイを用いて、trm8Δ trm4Δ温度感受性修飾変異体（m7G46とm5Cを欠損）と関連株のtRNAレベルを半減期条件下でゲノム規模で比較することであった。 このようにして、RTD基質であるtRNAVal(AAC)が、trm8Δ trm4Δ変異体ではWTまたは対応する単一変異体に比べてtRNA量が減少していたことから、同定した (Alexandrov et al., 2006)
Figure 1. RTD基質の同定および解析に用いた異なるアプローチ。
第2のアプローチでは、温度感受性修飾変異体におけるRTD基質に対するtRNA分解の速度と特異性の両方を調べるためにノーザンブロットを使用した。 このアプローチでは、温度シフト後の異なる時点の細胞から単離されたRNAを、特定のtRNAのレベルについて分析した。 この解析から、trm8Δ trm4Δ変異体では、28℃から37℃へのシフト後30分以内にtRNAVal（AAC）の50%が分解され、同様に低修飾のtRNAiMet、tRNAMet、tRNAPheは減少しないことがわかった（Alexandrov et al.） さらに、酸性条件下でノーザンブロットを行うことにより、荷電tRNAと非荷電tRNAの相対レベルを測定することができた。その結果、trm8Δtrm4Δ変異体では荷電tRNAVal（AAC）のレベルが温度シフトの25分以内に50％減少し、非荷電tRNAVal（AAC）のレベルは影響を受けないようであった（Alexandrov et al, 第三の方法は、高コピーtRNA抑制で、特定のtRNAを発現する高コピープラスミドを、温度感受性tRNA修飾変異体に導入したものである。 もし、そのtRNAがRTD基質であり、温度感受性が単一のtRNA種が分解された結果であれば、そのtRNAを過剰発現させれば欠陥が抑制されるはずである。 このように、trm8Δ trm4Δ変異体の温度感受性は、tRNAVal（AAC）を発現するハイコピープラスミドによって抑制されることがわかった。これは、温度感受性が主にtRNAVal（AAC）の消失に起因し、失われた修飾がtRNAの安定性に重要であることを示すものである（Alexandrov et al.） 同様に、他のいくつかのtRNA修飾変異体のRTD基質もこの方法を用いて同定されており、tan1Δ trm44Δ変異体（ac4C12およびUm44を欠損）のtRNASer（CGA）およびtRNASer（UGA）、trm1Δ trm4Δ変異体（m2，2G26およびm5Cを欠損）（Chernakov，Whiple他，2008；Dewe他，2007）がこれに該当した。 2012; Kotelawala et al., 2008）。
第四に、我々は、tRNASerファミリーのRTD決定要因を特定するために、WTおよびmet22Δ株において単一の必須tRNASer（CGA）遺伝子（SUP61）を異なるtRNASer（CGA）変異体と置換し、異なる温度で増殖するアッセイ法を用いている。 この方法を用いて、アクセプターとT-ステムの安定性の組み合わせが、tRNASer(CGA)遺伝子ファミリーのRTD感受性の強い決定因子であることを明らかにした(Whipple et al., 2011)。 この結論は、RTDを測定する第5のアプローチによってさらに支持された。このアプローチでは、ac4C12とUm44を欠く、あるいはアクセプターステムに不安定化変異を持つtRNASer(CGA)変異体は、Xrn1による消化を受けやすく、子牛腸ホスファターゼによる5′リン酸除去に対してより感受性があることを試験管内で証明した（Whipple et al, 3132>
このレビューでは、RTD経路の理解を深める上で非常に有益であることが証明された、RTD基質の研究のために最近開発した6番目と7番目のアプローチについて説明します。 第6のアプローチは、蛍光レポーターを用いて、WT株とmet22Δ株における数千のtRNA変異体のライブラリーを包括的に解析するものである。 このアプローチにより、643のRTD基質候補を同定しましたが、その多くは以前の研究（Guy et al.、2014年）に基づいてRTDを誘発することが予想されない領域にありました。 3132>
7つ目のアプローチは、WT株とmet22Δ株のtRNAレベルを測定するためにポイズンプライマー伸長を採用し、配列が1残基しか違わないWT tRNAの存在下でもバリアントtRNAを特異的に測定できる点で貴重である。 この手法の詳細な方法論と、その応用例について紹介する。