Estructura del tejido blando fósil
Pequeñas manchas de tejido (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d y Figs. 2-6 suplementarias) están estrechamente asociadas a las plumas fósiles (es decir, normalmente a menos de 500 µm de los residuos de plumas carbonosas, Fig. Suplementaria 2e, g, j, k, o, s, t). Las manchas son definitivamente de tejido fósil, y no reflejan la contaminación de la superficie con material moderno durante la preparación de la muestra, ya que se conservan en fosfato de calcio (véase «Tafonomía», más abajo); además, varias muestras muestran márgenes que están superpuestos, en parte, por la matriz circundante. Por lo tanto, los tejidos no se han adherido simplemente a la superficie de la muestra como resultado de la contaminación por partículas transportadas por el aire en el laboratorio.
Tejidos blandos fosfatados en dinosaurios maniraptorios no avianos y en un ave basal. a-h Imágenes de retrodispersión electrónica de tejidos de Confuciusornis (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosaurus (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosaurus (IVPP V 12811; c, h) y Microraptor (IVPP V 17972A; d). a-d Pequeños parches de tejido de forma irregular. e Detalle de la superficie del tejido mostrando la textura poligonal. f Sección vertical fresada con haz de iones enfocada a través del tejido blando mostrando la capa fibrosa interna que separa dos capas sin estructura. g, h Sección oblicua fracturada a través de los tejidos blandos, mostrando las capas visibles en f
Los parches de tejido son típicamente de 3-6 µm de grosor y planos (Fig. 1a-e). Las secciones transversales y las superficies fracturadas muestran una capa fibrosa interna (de 1,0-1,2 µm de grosor) entre dos capas sin estructura más finas (de 0,2-0,5 µm de grosor) (Fig. 1f-h). La superficie externa de la capa sin estructura es lisa y puede mostrar una sutil textura poligonal definida por polígonos de 10-15 µm de ancho (Fig. 1e, h).
La capa fibrosa también muestra polígonos (Figs. 1f, h y 2a-e, y Fig. 6 suplementaria) que contienen conjuntos de fibras densamente empaquetadas de 0,1-0,5 µm de ancho (Fig. 2f-i y Fig. 5f suplementaria). Las fibras bien conservadas muestran una torsión helicoidal (Fig. 2h, i). Las fibras de las partes marginales de cada polígono tienen una anchura de 0,1-0,3 µm y están orientadas en paralelo a la superficie del tejido; las del interior de cada polígono tienen una anchura de 0,3-0,5 µm y suelen ser perpendiculares a la superficie del tejido (Fig. 2b, h y Supplementary Fig. S6d). En los 1-2 µm marginales de cada polígono, las fibras suelen ser ortogonales al margen lateral del polígono y terminan en la unión entre polígonos adyacentes o hacen de puente entre ellos (Fig. 2f, g y Supplementary Fig. 6e). Los polígonos suelen ser equidimensionales pero son localmente alargados y se alinean mutuamente, donde las fibras gruesas de cada polígono son subparalelas a la superficie del tejido y las finas, paralelas al margen del polígono (Fig. 2j, k y Supplementary Fig. 6g-l). Algunos polígonos muestran una depresión central (Fig. 2c-e y Supplementary Fig. 6a-c) en la que las fibras gruesas pueden envolver una estructura globular de 1-2 µm de ancho (Fig. 2e).
Ultraestructura de los tejidos blandos en Confuciusornis (IVPP V 13171). a, b Micrografías electrónicas de retrodispersión; todas las demás imágenes son micrografías electrónicas secundarias. a, b Polígonos estrechamente empaquetados. c Detalle de los polígonos mostrando el contenido fibroso, con d dibujo interpretativo. e-g Polígono (e) con detalle de las regiones indicadas mostrando las tonofibrillas en puente (f) y colindando en (g) la unión entre polígonos. h, i Enrollamiento helicoidal en las tonofibrillas. h Vista oblicua del polígono con las tonofibrillas centrales orientadas perpendicularmente a la superficie del polígono. j, k Polígonos que muestran una deformación en forma de estiramiento
Corneocitos fósiles
La textura de estos tejidos fósiles difiere de la de las conchas de los conchostracanos y de las escamas de los peces del sedimento anfitrión, de la concha del Mytilus moderno, del raquis de las plumas modernas y fósiles y de la epidermis de los reptiles modernos (Fig. suplementaria 7a-n). La geometría alargada de algunos polígonos (Fig. 2j, k y Fig. Suplementaria 6g, l) implica la deformación elástica de un tejido no biomineralizado debido a la tensión mecánica. Sobre la base de su tamaño, geometría y estructura interna, las estructuras poligonales se interpretan como corneocitos (queratinocitos epidérmicos). En los amniotas modernos, se trata de células poliédricas y aplanadas (1-3 µm × ca. 15 µm) llenas de tonofibrillas de queratina, lípidos y proteínas de matriz18,19,20 (Fig. 3a, b y Figs. 2u-x, 8, 9). La capa externa sin estructura del material fósil corresponde al margen celular; es más gruesa que la plantilla biológica original, es decir, la envoltura celular córnea y/o la membrana celular, pero esto no es inesperado, ya que refleja el sobrecrecimiento diagenético por fosfato de calcio (véase «Tafonomía»). Las fibras de los corneocitos fósiles se identifican como tonofibrillas mineralizadas: haces rectos y no ramificados de fibrillas de α-queratina superenrolladas de 0,25-1 µm de ancho18,21 que son el principal componente del citoesqueleto de los corneocitos22 y están envueltas por proteínas amorfas del citoesqueleto22. En los fósiles, las delgadas tonofibrillas a menudo colindan con las de la célula adyacente (Fig. 2g y Fig. 6e suplementaria), pero localmente pueden salvar el límite entre células adyacentes (Fig. 2f). Esto último recuerda a los desmosomas, regiones de fuerte unión intercelular entre los corneocitos modernos23. Las estructuras globulares centrales dentro de los corneocitos fósiles se asemejan a los núcleos de las células muertas24, como en los corneocitos de las aves actuales (pero no de los reptiles y mamíferos actuales)24 (Fig. 8 suplementaria). La posición de estos núcleos picnóticos suele estar indicada por depresiones en la superficie del corneocito en las aves actuales24 (Fig. 3b); algunas células fósiles muestran depresiones similares (Fig. 2c y Fig. Suplementaria 6a-c).
Corneocitos en aves existentes. a-d Micrografías electrónicas de barrido de piel desprendida en pinzón cebra existente (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d). a Corneocitos que definen la textura poligonal. b La depresión central (flecha) marca la posición del núcleo picnótico. c, d Escamas de piel desprendida arrastradas dentro de las plumas
Tafonomía
La queratina es una biomolécula relativamente recalcitrante debido a su estructura paracristalina fuertemente reticulada y a su carácter hidrofóbico no polar23. La replicación de los corneocitos fósiles en fosfato de calcio es, por tanto, algo inesperado, ya que este proceso suele requerir gradientes geoquímicos pronunciados característicos de la descomposición temprana25 y suele aplicarse a tejidos propensos a la descomposición, como el músculo26 y los tejidos digestivos27. Sin embargo, los tejidos recalcitrantes, como el colágeno dérmico, pueden reproducirse en fosfato cálcico cuando contienen una fuente inherente de calcio y, en particular, iones de fosfato que se liberan durante la descomposición28. Los corneocitos contienen fuentes de ambos iones. Durante la diferenciación terminal, las concentraciones intracelulares de calcio aumentan29 y las cadenas de α-queratina se fosforilan ampliamente23. Además, los gránulos lipídicos de los corneocitos30 son ricos en fósforo y fosfato31. Estos elementos químicos se liberarían durante la degradación de los gránulos y se precipitarían sobre el sustrato orgánico restante, es decir, las tonofibrillas.
En los mamíferos existentes, las matrices de tonofibrillas densamente empaquetadas requieren abundantes proteínas de la matriz interqueratina para su estabilidad32. Estas proteínas, sin embargo, no son evidentes en los fósiles. Esto no es inesperado, ya que las proteínas son escasas en los corneocitos aviares existentes33 y, críticamente, se presentan como monómeros dispersos34 y tendrían un potencial de conservación menor que los haces de queratina altamente reticulados y polimerizados de las tonofibrillas. La capa externa sin estructura de los corneocitos fósiles es más gruesa que la(s) probable(s) plantilla(s) biológica(s), es decir, la envoltura celular córnea (una capa de lípidos, queratina y otras proteínas de hasta 100 nm de espesor que sustituye a la membrana celular durante la diferenciación terminal34) y/o la membrana celular. Esto puede reflejar un microentorno local propicio para la precipitación de fosfato cálcico: durante la diferenciación terminal, los gránulos de queratohialina, una proteína extensamente fosforilada35 con una alta afinidad por los iones de calcio36, se acumulan en la periferia de los corneocitos en desarrollo37. El grosor de la capa sólida externa de fosfato cálcico en los fósiles, más la transición gradual de ésta a la capa fibrosa interna, sugiere que la precipitación de fosfato procedió desde los márgenes hacia el interior de los corneocitos. En este escenario, la disponibilidad de fosfato en las zonas marginales de las células habría superado la requerida para replicar las tonofibrillas. El fosfato adicional habría precipitado como fosfato cálcico en los espacios intersticiales entre las tonofibrillas, progresando hacia el interior desde la cara interna del margen de la célula.
El desprendimiento de la piel en los dinosaurios emplumados y en las aves primitivas
En los amniotas existentes, la capa epidérmica cornificada tiene un grosor típico de 5 a 20 células (pero el grosor varía según la especie y la ubicación en el cuerpo38). Los parches de corneocitos fósiles, sin embargo, tienen una célula de grosor (Fig. 1f y Figs. Suplementarias 5c, 10). Esto, más el consistente pequeño tamaño (<400 μm) de los parches y la notablemente alta fidelidad de la preservación, es inconsistente con la preservación selectiva de una hoja continua de tejido in situ. En una minoría (n = 8) de ejemplos, la piel aparece en el borde de la muestra de tejidos blandos fósiles y, por lo tanto, podría representar potencialmente un fragmento más pequeño de una pieza originalmente más grande de piel fósil (con el resto de la pieza en la losa fósil). Sin embargo, en la mayoría de los ejemplos, todo el contorno del fragmento de piel está contenido en el margen de una muestra. El examen de los márgenes de varias muestras a gran aumento revela que la muestra y el sedimento circundante están a menudo exactamente en el mismo plano (por ejemplo, la Fig. 10 suplementaria). Incluso cuando el margen de la muestra de piel está cubierto por el sedimento, es poco probable que la muestra haya sido mucho mayor que el tamaño aparente, ya que la piel fósil, al ser casi perfectamente plana, forma un plano natural de hendidura.
No hay evidencia de que el grosor conservado de la piel sea un artefacto de preparación o erosión. Durante la división de una losa de roca, el plano de división pasa frecuentemente a través de los tejidos blandos de forma desigual, exponiendo estructuras a diferentes profundidades. En los fósiles estudiados aquí, el plano de hendidura suele pasar a través de los corneocitos (exponiendo su estructura interna), y raramente a lo largo de la cara externa de la capa de corneocitos. No hay pruebas de la eliminación de más de una capa de corneocitos: Las secciones de FIB muestran la preservación de una sola capa y varias imágenes de SEM muestran secciones verticales completas a través de la piel preservada (donde la relación con el sedimento sobre y subyacente es visible), con evidencia de una sola capa de corneocitos. El relleno interno fibroso de los corneocitos fósiles está expuesto donde el plano de división de la losa fósil pasa a través de los parches de tejido. La topografía de los corneocitos fósiles, sin embargo, varía con la posición del plano de hendidura, que puede variar localmente a través de los tejidos blandos a escala milimétrica: los corneocitos pueden presentarse con márgenes elevados y una depresión central, o con márgenes deprimidos y una zona central elevada (Fig. S9).
El tamaño, la geometría irregular y el grosor de los parches de corneocitos se asemejan a escamas desprendidas de la capa cornificada (partículas similares a la caspa39; Fig. 3). En las aves actuales, los corneocitos se desprenden individualmente o en parches de hasta 0,5 mm2 que pueden ser arrastrados dentro de las plumas (Fig. 3c, d y Fig. Suplementaria 2u, v). Los fósiles aquí descritos proporcionan la primera evidencia del proceso de muda de piel en aves basales y dinosaurios maniraptorianos no avianos y confirman que al menos algunos dinosaurios no avianos mudan su piel en pequeños parches40. Este estilo de muda es idéntico al de las aves modernas18 (Fig. 3c, d) y los mamíferos20 e implica un crecimiento somático continuo. Esto contrasta con muchos reptiles actuales, por ejemplo lepidosaurios, que mudan su piel entera o en grandes secciones21, pero el estilo de muda puede estar influenciado por factores como la dieta y el entorno41.
Implicaciones evolutivas de la estructura de los corneocitos fósiles
Los corneocitos fósiles muestran adaptaciones clave que se encuentran en sus homólogos de aves y mamíferos actuales, especialmente su geometría poligonal aplanada y su contenido celular fibroso consistente con las tonofibrillas de α-queratina16. Además, las tonofibrillas fósiles (al igual que en los ejemplos actuales22) muestran sólidas conexiones intercelulares y forman un andamiaje continuo a lo largo de la lámina de corneocitos (Fig. 2b, c, j y Fig. 6 suplementaria). Por el contrario, los corneocitos de los reptiles existentes contienen una masa homogénea de β-queratina (con proteínas adicionales presentes en la envoltura celular) y se fusionan durante el desarrollo, formando capas β maduras sin límites celulares distintivos42. La retención de núcleos picnóticos en los corneocitos fósiles es una característica claramente aviar que no se observa en los reptiles modernos (pero véase la ref. 20).
Se considera que la morfogénesis y la diferenciación epidérmicas han divergido en los terápsidos y los saurópsidos31. Nuestros datos apoyan otras evidencias de que los rasgos epidérmicos compartidos en aves y mamíferos indican una evolución convergente43 y sugieren que los contenidos corneocitarios ricos en lípidos pueden ser caracteres evolutivamente derivados en aves y maniraptoranos no avianos con plumas. Los estudios de Evo-devo han sugerido que la epidermis aviar podría haber surgido a partir de la expansión de las regiones de bisagra en la piel escamosa «protopluma «20. Aunque faltan pruebas fósiles de esta transición, nuestros datos muestran que la epidermis de las aves basales y de los dinosaurios maniraptorianos no avianos ya había desarrollado un carácter decididamente moderno, incluso en los taxones que no son capaces de volar con motor. Esto no excluye la posibilidad de que al menos algunos de los rasgos epidérmicos descritos aquí se hayan originado en terópodos más basales, especialmente cuando la piel conservada carece de evidencia de escamas (como en Sciurumimus44). Los mecanismos genómicos refinados para modular la compleja expresión de la queratina en la epidermis45 , la diferenciación terminal de los queratinocitos y la partición de la síntesis de α- y β-queratina en la piel de los animales emplumados32 se modificaron probablemente junto con la evolución de las plumas cerca de la base del Maniraptora a finales del Jurásico Medio (Fig. 4). Los datos fósiles existentes sugieren que esto ocurrió después de la evolución del pico en los Maniraptoriformes y antes de la evolución de la patagia de las extremidades delanteras y los pteriglos (Fig. 4); las primeras apariciones fósiles de todos estos rasgos abarcan unos 10-15 Ma, lo que sugiere un estallido de innovación en la evolución de los tegumentos emplumados cerca del límite del Jurásico Inferior-Medio y a través de él. La primera evidencia de musculatura dérmica asociada a las plumas es aproximadamente 30 Ma más joven, en un ave ornitotora de 125 Ma17. Dado el papel esencial que desempeña esta red dérmica en el soporte de las plumas y en el control de su orientación18, su ausencia en los maniraptores no avianos emplumados puede reflejar un sesgo tafonómico.
Filogenia esquemática, escalada al tiempo geológico, de coelurosaurios seleccionados que muestra el patrón de adquisición de modificaciones clave de la piel. La filogenia es la más probable de los modelos de máxima verosimilitud, basada en las longitudes de rama mínima (mbl) y en las transiciones que se producen como todas las tasas-diferentes (ARD). Las garras y las almohadillas de los pies se consideran primitivas en los coelurosaurios. Los datos disponibles indican que los queratinocitos modificados, y la muda continua, se originaron cerca de la base del Maniraptora; se prevé que esto se desplace en base a futuros descubrimientos fósiles hacia la base de los coelurosaurios para incluir otros taxones emplumados
En ciertos aspectos, los corneocitos fósiles son claramente no avianos e indican que los dinosaurios emplumados y las aves primitivas tenían una anatomía y fisiología integumentaria única de transición entre la de las aves modernas y la de los dinosaurios no emplumados. En las aves actuales, las tonofibrillas de los corneocitos están dispersas entre los lípidos intracelulares19 ; esto facilita la refrigeración por evaporación en respuesta a la producción de calor durante el vuelo y el aislamiento por el plumaje46. En cambio, las tonofibrillas fósiles están densamente empaquetadas y llenan el interior de la célula. No hay evidencias de que los corneocitos fósiles se hayan encogido después de la muerte: el rango de tamaño es consistente con los de las aves modernas, y no hay evidencias de arrugas diagenéticas, contorsión o separación de células individuales. Esto sugiere fuertemente que la densidad conservada de tonofilamentos en los corneocitos fósiles refleja densidades originalmente más altas que en las aves actuales. Esto no es una función del tamaño del cuerpo: las aves existentes de tamaño dispar (por ejemplo, el pinzón cebra y el avestruz) muestran tonofibrillas poco dispersas47. Por tanto, es probable que las aves fósiles tuvieran una menor necesidad fisiológica de refrigeración por evaporación y, a su vez, una menor producción de calor corporal relacionada con la actividad de vuelo46 que en las aves modernas. Esto es consistente con otras evidencias de bajas tasas metabólicas basales en dinosaurios maniraptorianos no avianos47,48 y aves basales47 y con las hipótesis de que las plumas de Microraptor49 y, potencialmente, de Confuciusornis48 (pero ver ref. 50) no estaban adaptadas para el vuelo con motor, al menos durante períodos prolongados50.