1 de junio de 2016 (Vol. 36, nº 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Fundadora y escritora principal DeeAnn Visk Consulting
La terapia génica debe romper las murallas celulares sin recrear la caída de Jericó en miniatura
Las inmunoterapias contra el cáncer, las vacunas contra los nuevos virus (o los viejos virus en nuevos lugares), y los intentos de resolver los defectos patógenos de una sola célula: todos buscan incorporar la tecnología de transfección. Esta tecnología, que engloba diversos medios para introducir ácidos nucleicos en las células, es muy prometedora, pero también plantea serios retos.
Estos retos han sido más destacados en los intentos de desplegar la terapia génica, que ha tenido dificultades para abordar el problema de las células, órganos y animales enteros difíciles de transfectar.
Estos retos de transfección han sido asumidos por varias empresas de biotecnología. Por ejemplo, MaxCyte, Lonza y Mirus Bio ofrecen la electroporación como un método que deja pocos residuos. Sin embargo, la electroporación no es adecuada para todos los animales, por lo que se necesitan otros métodos. Una técnica alternativa es la infección viral. La emplean empresas como GenVec.
Otro reto, especialmente relevante para la transfección viral, es la posibilidad de estimular una respuesta inmunitaria. Sin embargo, este potencial negativo puede ser realmente positivo en el contexto adecuado, que resulta ser el desarrollo de vacunas. Aprovechar los enfoques de transfección viral para potenciar los mecanismos de vacunación es una especialidad de Thermo Fisher Scientific. La empresa también ofrece una transfección tradicional basada en productos químicos que funciona en todo el animal.
En conjunto, las empresas mencionadas hasta ahora ofrecen tecnologías que cubren todos los modos principales de transfección terapéutica: transfección basada en productos químicos, métodos no químicos (principalmente la electroporación) y transducción viral. También se están desarrollando enfoques híbridos, como se verá en las siguientes secciones.
Electroporación
La plataforma de electroporación de MaxCyte cumple con las GMP y es perfectamente escalable desde la investigación hasta la escala comercial. «Nuestro sistema de electroporación de flujo permite transfectar de un millón a varios cientos de miles de millones de células en menos de 30 minutos en un sistema cerrado totalmente automatizado», explica el doctor Madhusudan V. Peshwa, CSO. «Nuestro sistema cumple con la norma ISO 9000 y la FDA, por lo que puede adaptarse fácilmente a las necesidades de la fabricación a nivel terapéutico.
«Colaboramos habitualmente con empresas farmacéuticas y biotecnológicas para desarrollar terapias de células inmunitarias y madre ex vivo. A veces el objetivo es fabricar rápidamente vacunas y fármacos biológicos de alto rendimiento, como los anticuerpos. Otras veces, permitimos a los clientes crear una producción a gran escala de vectores virales de alto título utilizando células en suspensión y adherentes. Esto no sólo ayuda al desarrollo terapéutico, sino que también puede acelerar las aplicaciones de descubrimiento de fármacos»
Esta capacidad de procesar células en números grandes o pequeños permite a los científicos en el banco desarrollar un protocolo de proceso utilizando la electroporación de flujo para números pequeños de células. La ampliación de este proceso se realiza sin los habituales dolores de cabeza para mantener la calidad, ya que el proceso de transfección sigue siendo el mismo.
«Esta reducción del riesgo es muy atractiva para nuestros socios. Garantizar la coherencia desde la investigación hasta la clínica, pasando por la escala comercial y de una ejecución a otra, de un donante a otro y de un paciente a otro es fundamental para guiar eficazmente las terapias a través del proceso de desarrollo», afirma el Dr. Peshwa.
Aunque los enfoques químicos y lipídicos funcionan bien en la investigación con líneas celulares establecidas, a menudo hay consecuencias imprevistas en la transfección de células primarias. Además, estos medios químicos tradicionales de transfección de células son difíciles de escalar a la producción industrial.
La electroporación, el enfoque no viral empleado por MaxCyte, permite que la biología de las células transfectadas permanezca en un estado más natural a cualquier escala. Al prevenir las consecuencias no deseadas durante el proceso de transfección, la tecnología de MaxCyte puede evitar la creación de obstáculos al tiempo que resuelve la necesidad de una alta eficiencia de transfección.
«Estas intervenciones terapéuticas necesitan estar prácticamente garantizadas para tener un mínimo impacto negativo no deseado en las células que se modifican: toda la biología debe ser la misma durante cada etapa del proceso», insiste el Dr. Peshwa. «Además, nuestro sistema de electroporación en flujo puede utilizarse de forma automatizada. Ya se utiliza de forma rutinaria en Japón para tratamientos terapéuticos comerciales y se encuentra en varias fases de adopción en todo el mundo».
Otra consideración es dónde se realiza la transfección. ¿Se transportan las células extraídas de un paciente a otra ciudad para su procesamiento? ¿Qué ocurre cuando un paquete se pierde, o se retrasa, o experimenta fluctuaciones de temperatura? La plataforma que ofrece MaxCyte ofrece la oportunidad de desarrollar nuevas terapias mediante el procesamiento in situ de las células de los pacientes, evitando los principales problemas logísticos y de costes de producción de otros métodos.
La ingeniería de las células es fundamental para el desarrollo de terapias celulares. El sistema de electroporación de MaxCyte puede evitar la modificación no intencionada del fenotipo celular al tiempo que satisface las necesidades clave de los desafíos de la ingeniería celular: eficiencia, consistencia, portabilidad y escalabilidad, según la empresa.
Transducciones virales
Los vectores virales son especialmente útiles para la transfección de todo el animal o para su uso con tejidos que pueden ser difíciles de alcanzar mediante enfoques químicos o de electroporación. GenVec se especializa en el uso de vectores virales, específicamente el adenovirus, para entregar genes con fines terapéuticos.
«A primera vista, los problemas asociados con la respuesta inmune a los vectores virales parecen ser problemáticos», explica el doctor Doug Brough. «Sin embargo, hemos descubierto que puede utilizarse para estimular una respuesta inmunitaria a materiales extraños, de modo que los adenovirus podrían emplearse para administrar vacunas».
De hecho, GenVec ha estudiado a fondo el adenovirus y ha generado varios «sabores» diferentes de adenovirus. Al explorar los adenovirus en otras especies, como los gorilas y los monos, los investigadores pueden utilizar vectores diseñados para evitar la inmunidad preexistente que la población humana en general tiene contra los adenovirus.
«La gran biblioteca de vectores que ofrece GenVec se llama Adenoverse™», informa el Dr. Brough. «Hemos eliminado grandes secciones del adenovirus para limitar la toxicidad innata asociada al tratamiento con adenovirus. Además de evitar una respuesta inmunitaria deletérea al vector, esto nos permite introducir hasta 12 kb en el virus».
Al utilizar una variedad de enfoques, GenVec ha trabajado con varias empresas en diferentes aplicaciones, terapias de ácidos nucleicos y tecnologías de edición de genes. Los adenovirus modificados pueden suministrar enfoques de dedos de zinc, tanto in vitro como in vivo.
Un ejemplo de una de estas colaboraciones se encuentra en el ensayo clínico de Novartis para regenerar células sensoriales en el oído interno. «Infectando las células del oído interno con un gen que codifica una proteína reguladora clave, se pueden generar nuevas células mecanosensoriales para sustituir las perdidas por lesiones o condiciones genéticas inherentes», explica el Dr. Brough.
Otros proyectos conjuntos se pueden encontrar con asociaciones en entidades para tratar el cáncer y desarrollar vacunas. «Cuando llega el momento de comercializar una tecnología, GenVec utiliza una línea celular previamente aprobada por la FDA para estas aplicaciones», aclara el Dr. Brough.
«Otra ventaja evidente de utilizar adenovirus es que pueden transfectar fácilmente animales enteros. Por ejemplo, una enfermedad devastadora en los animales de granja, llamada fiebre aftosa, se perpetúa mediante una variedad de virotipos. Nuestro sistema podría permitir el intercambio rápido de cualquier cepa que esté causando un brote y permitir que se suministre rápidamente una vacuna a medida», describe el Dr. Brough.
Nucleofección
Lonza ofrece una forma avanzada de electroporación llamada Nucleofection™, que utiliza soluciones de transfección específicas para cada tipo de célula junto con un sistema de entrega de pulsos más matizado que permite la transfección de muchos tipos de células diferentes, especialmente células humanas primarias normales.
«En lugar de utilizar soluciones tampón de electroporación estándar, utilizamos soluciones de transfección específicas para cada tipo de célula», dice Gregory Alberts, Ph.D., experto global en la materia de Lonza. «Esto nos permite estabilizar los poros generados durante la entrega de pulsos. Especulamos que los poros formados en la membrana celular durante la electroporación estándar se cierran rápidamente. Nuestra tecnología estabiliza los poros formados por la electroporación y permite que el material se difunda en la célula y, más concretamente, en el núcleo de la misma».
El enfoque de Nucleofección utiliza muchos sustratos diferentes: ADN, ARNm, ARNsi, péptidos, proteínas y pequeñas moléculas. Las eficiencias de transfección de siRNAs y mRNAs son muy buenas, superiores al 90%. Los péptidos pequeños suelen transfectar con una eficacia de alrededor del 80%, y la eficacia del ADN plasmídico oscila entre el 50% y el 90%, dependiendo del tipo de célula. Incluso los sustratos grandes, las proteínas de mayor tamaño como los anticuerpos o los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), pueden entrar en las células objetivo con eficiencias de transfección razonablemente eficaces.
«La nucleofección es sorprendentemente flexible», declara el Dr. Alberts. «Se ha utilizado para transfectar todo tipo de células humanas primarias. Se ha utilizado en la generación de iPSC (células madre pluripotentes inducidas), la transfección de CRISPR y otros sustratos de edición del genoma, así como en la transfección de objetivos más exóticos como la familia de parásitos Plasmodium que causan la malaria. Otros organismos similares también pueden ser transfectados con Nucleofection para permitir la investigación de enfermedades tropicales»
La plataforma Nucleofection es escalable. Por ejemplo, el sistema de Nucleofección de alto rendimiento puede manejar formatos de 96 y 384 pocillos. A menudo, este sistema se empleará en una instalación de cribado central. Los científicos en el banco pueden utilizar el Nucleofector 4D de menor rendimiento para optimizar las condiciones del ensayo. Dado que el Nucleofector 4D de sobremesa utiliza las mismas condiciones de transfección, trabaja con el mismo número de células y ofrece el mismo rendimiento que los dispositivos de mayor rendimiento, cuando llega el momento de pasar a una escala mayor, el ensayo no requiere una reoptimización.
«La continuidad del sistema permite comparar manzanas con manzanas a medida que se escala el proyecto hacia arriba o hacia abajo», ilustra el Dr. Alberts.
«Estamos en proceso de probar la versión beta de un nuevo dispositivo de transfección de gran volumen que podrá transfectar de 200 millones a mil millones de células en un formato que va de 1 a 20 mL. Los resultados preliminares muestran que el dispositivo transfecta células humanas primarias o líneas celulares a los mismos niveles que los otros dispositivos Lonza Nucleofector», continúa el Dr. Alberts. «Este producto se pondrá a la venta únicamente con fines de investigación, aunque debido a la capacidad de Nucleofection para transfectar células humanas primarias tan bien, sin duda habrá interés en utilizar este dispositivo en aplicaciones más orientadas a la clínica»
El Dr. Alberts prevé que la nucleofección podría desempeñar un papel en terapias innovadoras y personalizadas contra el cáncer, como la terapia con células T de antígenos quiméricos (CAR-T), así como en otras terapias celulares que requieran la transfección o la modificación genómica de células humanas primarias.
«La capacidad de la nucleofección para transfectar fácil y eficazmente células T humanas primarias atraerá la atención en enfoques de terapia génica para tratar enfermedades. El enfoque de Lonza para las potenciales aplicaciones de terapia génica también tiene una huella muy pequeña. Esto es crucial porque la maquinaria ‘sobrante’ de otras técnicas de transfección puede provocar consecuencias biológicas no deseadas», concluye el Dr. Alberts.
Los científicos de Lonza han evaluado la capacidad de la tecnología Nucleofection de la empresa para transfectar células musculares lisas de rata adulta (AoSMC) disociadas. Las AoSMCs de rata criopreservadas se descongelaron y cultivaron durante siete días en placas de cultivo de 24 pocillos, y las células se transfectaron en adherencia utilizando la solución AD1 4D-Nucleofector Y. Veinticuatro horas después de la transfección, se fijaron las células y se analizaron. La actina se muestra en rojo; la GFP, en verde.
Formulaciones
Mirus Bio desarrolla y fabrica novedosas formulaciones de transfección, que permiten la entrega de alta eficiencia y baja toxicidad de muchos tipos diferentes de moléculas de ácido nucleico. Muchas de las formulaciones no contienen componentes de origen animal. «Sin animales» es una cualidad importante para las aplicaciones preclínicas y clínicas.
El sistema CRISPR requiere la entrega de un ARN guía (ARNg) y la expresión de la endonucleasa Cas9, que puede estar en forma de proteína, ARNm o ADN. Mirus Bio ofrece soluciones de transfección para apoyar la entrega efectiva de todas las diferentes moléculas que codifican Cas9. Cuando se utilizan métodos de transfección química para la entrega de la proteína Cas9, los investigadores pueden utilizar niveles mucho más bajos de proteína si ésta está precomplejada con el ARNg.
«Algunos tipos de células difíciles de transfectar producen mayores eficiencias de corte con la transfección de la proteína Cas9 complejada dentro del complejo RNP (ribonucleoproteína)», afirma Laura Juckem, Ph.D., líder del grupo R&D en Mirus Bio. «El sistema de suministro dinámico Mirus TransIT-X2® suministra eficazmente los complejos RNP y permite utilizar concentraciones más bajas de proteína Cas9 en comparación con la electroporación.»
Otro reto al que se enfrentan las empresas es el paso de cultivos adherentes a cultivos en suspensión para dar cabida a la gran cantidad de material necesario para los ensayos clínicos. Esto es especialmente cierto para la producción de lentivirus recombinantes y virus adeno-asociados (AAV). «Trabajamos estrechamente con nuestros clientes para asegurarnos de que sus transfecciones tengan éxito y de que los cambios en su flujo de trabajo sigan produciendo un producto de alta calidad», explica el Dr. Juckem.
«Para la terapia basada en células, el sistema de expresión CHO-gro® se desarrolló para obtener altos rendimientos de proteínas bioterapéuticas en células CHO en suspensión. Este sistema optimizado favorece el crecimiento celular de alta densidad y permite a los investigadores obtener suficientes proteínas para realizar estudios preclínicos y análisis de caracterización iniciales», concluye el Dr. Juckem.
Esta imagen, procedente de una presentación de Mirus Bio en la que se describe la transfección de alta eficacia de células madre, indica que las células somáticas, como los fibroblastos adultos, pueden transfectarse o transducirse mediante varios métodos con una combinación de factores de transcripción. Una vez que las células han sido reprogramadas a un estado pluripotente, pueden ser guiadas a diferentes destinos mediante la adición de factores de crecimiento y/o la transfección de marcadores de selección dirigidos por promotores específicos del tipo de célula. La imagen destaca que los reactivos de transfección pueden añadirse a un flujo de trabajo con células madre en varios puntos.
Enfoques en animales enteros
Thermo Fisher Scientific se mantiene al tanto de las necesidades de los clientes de generar más datos biológicamente relevantes utilizando células primarias, en lugar de líneas celulares inmortalizadas. Las células primarias son tradicionalmente más difíciles de transfectar con métodos químicos. Sin embargo, los datos generados a partir de cultivos celulares primarios tienden a proporcionar respuestas que se traducen mejor en modelos in vivo de animales enteros.
Los modelos de cultivos celulares tridimensionales, que arrojan resultados más pertinentes que los cultivos celulares bidimensionales, son más difíciles de transfectar con los métodos tradicionales.
«La transfección de cultivos primarios con ADN es un reto. Utilizar directamente ARNsi (ácido ribonucleico inhibidor pequeño), ARNm (ARN mensajero) y proteínas es más fácilmente aceptado por las células primarias, ya que estos compuestos sólo tienen que ser entregados al citoplasma y no al núcleo celular», afirma Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D., director de R&D en Thermo Fisher Scientific.
«La entrega al núcleo se produce a medida que las células se dividen», prosigue el Dr. de Mollerat «Como las células primarias no se dividen tan fácilmente como las líneas celulares, podemos sortear el problema entregando las moléculas al citoplasma en lugar de al núcleo.»
Continuando con la búsqueda de sistemas más relevantes desde el punto de vista biológico en animales enteros, «hemos descubierto que el uso in vivo de Invivofectamine® 3.0 puede derribar eficazmente la expresión de una proteína en un 90% en las células del hígado», articula el Dr. de Mollerat. «Este uso in vivo de Invivofectamine ofrece a los científicos un modelo más eficaz de cómo son los tratamientos en el animal completo».
Otra aplicación de la tecnología de transfección es el desarrollo de vacunas. Los plazos para el desarrollo de vacunas pueden acortarse enormemente si se utilizan ARNm transfectados para expresar antígenos contra los que el organismo pueda desarrollar una respuesta inmunitaria. Dado el número de nuevos virus que se encuentran en el mundo, como el Zika y el chikungunya, tener la capacidad de desarrollar rápidamente vacunas mejorará en gran medida la salud mundial.
Con el desarrollo continuo de terapias inmunológicas dirigidas a los cánceres, las células T a menudo se dirigen con receptores específicos. «Hemos trabajado con empresas interesadas en desarrollar estas terapias», elucida el Dr. de Mollerat. «Trabajamos estrechamente con las empresas para abordar las cuestiones de cómo fabricar estos tratamientos, hacerlos a gran escala y ponerlos a disposición de todo el mundo».
Invivofectamine 3.0 es un reactivo proporcionado por Thermo Fisher Scientific para la administración de ARNi in vivo. Según la empresa, una sola inyección produce un knockdown significativo en el día 1 y hasta 3 semanas. Este hallazgo surgió de un estudio en el que se inyectó el reactivo en la cola de un roedor a varias dosis (1, 0,5 y 0,25 mg/kg). El suero se recogió en los días 2, 5, 9, 16, 23 y 30, y se analizó la eliminación de la proteína FVII mediante un ensayo cromogénico. La empresa observó que una mayor cantidad de ARNsi en los complejos inyectados dio lugar a una reducción más duradera en el intervalo probado.