D Complex Formation
Protrombinase formatie bepaalt katalytisch een belangrijke modulerende gebeurtenis, omdat het complete complex 300.000 keer efficiënter is dan vrije factor Xa die in oplossing op protrombine inwerkt.24,72 Een implicatie van deze significante snelheidsverhoging is dat elke dissociatie van componenten uit het complex de enzymactiviteit significant en drastisch vermindert. De afwezigheid van het membraanoppervlak van de volledige katalysator resulteert in een 1000-voudig verlies in katalytische efficiëntie, terwijl de verwijdering van factor Va uit het complex resulteert in een 10.000-voudige afname in de snelheid van trombinevorming.24 Het membraanoppervlak is verplicht omdat het, hoewel het weinig bijdraagt aan de intrinsieke snelheid van katalyse, een omgeving biedt waarin zowel het factor Va-factor Xa-complex als het substraat kunnen coconcentreren.277 Protrombine lijkt zich grotendeels te concentreren op het membraanoppervlak van bloedplaatjes door middel van de receptormediate mechanismen die eerder zijn beschreven. Factor Va vormt door zijn membraanbindend vermogen een obligate en hoogaffinente interactie met factor Xa, omdat factor Xa zich niet aan geactiveerde bloedplaatjes bindt in afwezigheid van factor Va. Concentratie van reactanten aan het membraanoppervlak resulteert in hoge lokale concentraties van reagentia die de intrinsieke Km van de reactie overschrijden en de katalytische efficiëntie aanzienlijk verbeteren. Bovendien verhoogt factor Va de omloopsnelheid van de reactie door een mechanisme dat nog niet gerationaliseerd is.278
Complexvorming biedt protrombinase bestanddelen ook bescherming tegen remmers en/of inactiverende stoffen. In tegenstelling tot factor Xa vrij in oplossing, is factor Xa opgenomen in protrombinase (d.w.z. gecomplexeerd met membraan-gebonden factor Va) beschermd tegen remming door antitrombine III en heparine.72 Evenzo is factor Va opgenomen in protrombinase beschermd tegen proteolytische inactivatie door geactiveerd proteïne C109,110 – een proces dat in detail wordt besproken in de volgende paragraaf.
Intrinsiek Xase wordt gemoduleerd door een verscheidenheid van mechanismen die vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij protrombinase. Complexvorming resulteert in een ongeveer 2 × 107-voudige toename van de katalytische efficiëntie.217 De binding van factoren VIIIa en IXaβ aan trombine-geactiveerde bloedplaatjes verlaagt de Km voor factor X-activering 2500-voudig en stelt factor VIIIa in staat de kcat ongeveer 7500-voudig te verhogen. Antitrombine III kan factor IXaβ niet remmen in aanwezigheid van factor VIIIa en bloedplaatjes.279 Net als bij factor Va moduleert de complexvorming van factor VIIIa met factor IXaβ de activiteit ervan. De dissociatie van de A2-subeenheid van het heterotrimeer factor VIIIa, die resulteert in een volledig verlies van de cofactoractiviteit, wordt verhinderd door de associatie met factor IXaβ op een membraanoppervlak,280 evenals de inactivatie door APC.62,281
Omdat factor Va absoluut vereist is voor fysiologisch relevante trombinevorming, kunnen significante variaties in protrombine-activering tot stand worden gebracht via proteolytische, inactiverende veranderingen in de cofactor, gekatalyseerd door geactiveerd proteïne C. Proteolyse en inactivering vereisen dat de factor Va aan bloedplaatjes59,74 of aan het membraan gebonden is.282 Vroege studies toonden aan dat incubatie van geactiveerd proteïne C met trombine-geactiveerde bloedplaatjes een parallelle afname in factor Xa binding en prothrombine activering teweegbracht, wat suggereert dat na splitsing door geactiveerd proteïne C, factor Va geen factor Xa bindt.283,284 Daarom heeft geactiveerde proteïne C-gekatalyseerde inactivering van factor Va een dramatisch effect op de trombinevorming.
Menselijke bloedplaatjes zijn in staat de geactiveerde proteïne C-gekatalyseerde inactivering van plasma- en bloedplaatjes-afgeleide factor Va te bevorderen en te moduleren, hoewel deze twee cofactorpools geen gelijkwaardige substraten zijn met betrekking tot inactivering. Drie splitsingen in de zware keten van het menselijke factor Va molecuul zijn nodig voor efficiënte geactiveerd proteïne C-gekatalyseerde inactivering: splitsing bij Arg506, gevolgd door splitsingen bij Arg306 en Arg679,282,285 De splitsing bij Arg506 is sneller en gaat vooraf aan de membraanafhankelijke, inactiverende splitsing bij Arg306,282 Het trombine-geactiveerde oppervlak van menselijke bloedplaatjes speelt een belangrijke rol in de geactiveerd-eiwit C-gekatalyseerde inactivering van factor Va die van bloedplaatjes afkomstig is en de factor Va-variant, factor VaLeiden.109,110 Factor VaLeiden wordt verkregen door trombine-activering van factor VaLeiden, een variant waarin Arg506 is vervangen door glutamine, waardoor de splitsingsplaats van geactiveerd proteïne C op positie 506 in wezen is verwijderd.286 Bijgevolg hebben personen die homozygoot (en in sommige gevallen heterozygoot) zijn voor deze mutatie een slechte antistollingsreactie op geactiveerd proteïne C en lopen zij een verhoogd risico op veneuze trombose.287-De normale en gemuteerde cofactoren van bloedplaatjes worden vrijwel even snel geïnactiveerd door geactiveerd proteïne C; volledige inactivatie van beide van bloedplaatjes afkomstige cofactoren wordt echter nooit bereikt,109,110 omdat tot 50% van de oorspronkelijke activiteit overblijft. Deze resultaten staan in schril contrast met wat is waargenomen bij onderzoek naar de geactiveerde proteïne C-gekatalyseerde inactivering van factor Va van plasma en factor VaLeiden op synthetische fosfolipideblaasjes.290-292 In die onderzoeken wordt altijd volledige inactivering van de cofactoren waargenomen, hoewel factor VaLeiden van plasma aanzienlijk langzamer wordt geïnactiveerd dan normale factor Va van plasma. In onderzoeken met bloedplaatjes blijft een grotere restactiviteit van zowel factor Va als factor VaLeiden over wanneer trombine-geactiveerde bloedplaatjes als inactiverend membraanoppervlak worden gebruikt, in tegenstelling tot de bijna volledige inactivering wanneer synthetische fosfolipide blaasjes als inactiverend oppervlak worden gebruikt.110 Geactiveerde bloedplaatjes beschermen de van bloedplaatjes afgeleide cofactoren dus tegen inactivering door geactiveerd proteïne C.109,110
Geactiveerde bloedplaatjes beschermen ook de normale van plasma afkomstige factor Va tegen inactivering door geactiveerd eiwit C door de splitsing bij Arg506 te vertragen.110 In tegenstelling tot de van bloedplaatjes afkomstige cofactor kan de van plasma afkomstige factor Va echter volledig door geactiveerd eiwit C worden geïnactiveerd, hetgeen suggereert dat de twee verschillende cofactorpools (plasma vs. bloedplaatjes) verschillende substraten voor APC zijn.110 Deze studies bevestigen opnieuw het belang van bindingsgebeurtenissen voor de modulatie van de protrombinaseactiviteit. Zij tonen ook aan dat de membranen van bloedplaatjes en synthetische fosfolipiden geen gelijkwaardige oppervlakken zijn bij het reguleren van de vorming van enzymcomplexen. Samen geven deze studies aan dat bloedplaatjes procoagulerende gebeurtenissen in stand houden door een membraanoppervlak te verschaffen dat de inactivatie van cofactoren vertraagt en door een cofactormolecuul vrij te geven dat een geactiveerd proteïne C-resistent fenotype vertoont.
Het is interessant om te overwegen dat, op plaatsen van arterieel letsel, de factor VLeiden-mutatie misschien niet zo gemakkelijk arteriële trombose voorspelt, omdat de normale en variant van bloedplaatjes afgeleide cofactoren even resistent zijn tegen geactiveerd proteïne C op het oppervlak van het geactiveerde bloedplaatje. De aangetoonde rol van de factor VLeiden-mutatie bij het voorspellen van veneuze trombose287-289 kan een weerspiegeling zijn van de gedocumenteerde resistentie van de van plasma afkomstige factor VaLeiden-cofactor in vergelijking met de normale, van plasma afkomstige factor Va.290-292 De plasma-cofactorpool kan een belangrijkere rol spelen bij veneuze trombose omdat er geen significante bijdrage is van de bloedplaatjes. Op de plaats van een arteriële trombus daarentegen kan de van bloedplaatjes afgeleide cofactor, als gevolg van het vrijkomen en de activering ervan, aanwezig zijn in een concentratie die meer dan 600 maal die van de plasmacofactor bedraagt.106