Proteínas

La lisozima fue la primera enzima cuya estructura de rayos X se determinó a alta resolución. Esto lo consiguió en 1965 David Phillips, trabajando en la Royal Institution de Londres. Phillips propuso un mecanismo de acción de la lisozima basado principalmente en los datos estructurales. Desde entonces, el mecanismo de Phillips ha sido confirmado por pruebas experimentales, como veremos más adelante.

La lisozima se encuentra ampliamente en las células y secreciones (incluidas las lágrimas y la saliva) de los vertebrados, y la clara de huevo de gallina es particularmente rica en esta enzima. La lisozima cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos que unen el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) en los polisacáridos de las paredes celulares bacterianas. Al hacerlo, daña la integridad de la pared celular y, por tanto, actúa como agente bactericida. El enlace NAM-NAG se representa en la Figura 40, con el sitio de escisión por la lisozima indicado.

Figura 40 Parte del componente polisacárido de las paredes celulares bacterianas, mostrando la alternancia de residuos de ácido N-acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG). Este polisacárido es un sustrato para la lisozima, que hidroliza el enlace glicosídico en la posición indicada. (Para mayor claridad, y para permitir una representación lineal de la molécula, algunos de los enlaces se muestran en forma de zig-zag.)

La lisozima es una enzima relativamente pequeña. La lisozima de la clara de huevo de gallina consiste en un único polipéptido de 129 aminoácidos de longitud (Figura 41) con Mr 14 600. A partir de los datos de difracción de rayos X, podemos ver que hay una hendidura distintiva en la estructura de la lisozima (Figura 42). El sitio activo se encuentra en esta hendidura. En la secuencia de aminoácidos de la Figura 41 y en el modelo de relleno de espacio de la lisozima de la Figura 42, se han resaltado los residuos que recubren el bolsillo de unión al sustrato en la proteína plegada.

Figura 41 La secuencia de aminoácidos de la lisozima de la clara de huevo de gallina, con los residuos que recubren el bolsillo de unión al sustrato resaltados en gris. Asp 52 y Glu 35, residuos clave en el sitio activo, están resaltados en rojo y amarillo respectivamente.

Figura 42 Un modelo de relleno de espacio de la lisozima de clara de huevo de gallina en el que se han resaltado los residuos clave. Asp 52 está en rojo; Glu 35 está en amarillo; algunos de los residuos que recubren el bolsillo de unión del sustrato se muestran en gris.

El sitio activo de la lisozima es un surco largo que puede acomodar seis azúcares de la cadena de polisacáridos a la vez. Al unirse al polisacárido, la enzima hidroliza uno de los enlaces glicosídicos. Si los seis azúcares del tramo de polisacárido se identifican como A-F, el sitio de escisión se encuentra entre D y E, como se indica en la figura 40. Los dos fragmentos de polisacárido se liberan entonces. La Figura 43 representa las etapas de esta reacción, que también se describen en detalle a continuación.

Figura 43 El mecanismo catalítico de la lisozima. Obsérvese que sólo se muestran los residuos clave implicados en la catálisis (Glu 35 y Asp 52). Las etapas se describen en detalle en el texto. (Basado en Phillips, 1966)

1. Al unirse a la enzima, el sustrato adopta una conformación tensa. El residuo D se distorsiona (no se muestra en el diagrama) para acomodar un grupo -CH2OH que, de otro modo, haría un contacto desfavorable con la enzima. De este modo, la enzima obliga al sustrato a adoptar una conformación que se aproxima a la del estado de transición.

2. El residuo 35 de la enzima es ácido glutámico (Glu 35) con un protón que transfiere fácilmente al átomo O polar del enlace glucosídico. De este modo, el enlace C-O del sustrato se escinde (Figura 43a y b).

3. El residuo D del polisacárido tiene ahora una carga positiva neta; este intermediario de la reacción se conoce como ion oxonio (Figura 43b). La enzima estabiliza este intermediario de dos maneras. En primer lugar, un residuo de aspartato cercano (Asp 52), que está en forma de carboxilato con carga negativa, interactúa con la carga positiva del ion oxonio. En segundo lugar, la distorsión del residuo D permite que la carga positiva se comparta entre su átomo C y O. (Nótese que esta compartición de carga entre átomos se denomina resonancia de la misma manera que la compartición de electrones entre los átomos del grupo peptídico). Así, el intermedio del ion oxonio es el estado de transición. Normalmente, este intermediario sería muy inestable y reactivo. El Asp 52 ayuda a estabilizar el ion oxonio, pero no reacciona con él. Esto se debe a que, a una distancia de 3 Å, los grupos reactivos están demasiado separados.

4. La enzima libera ahora el residuo E con su polisacárido unido, dando lugar a un intermedio glucosil-enzima. El ion oxonio reacciona con una molécula de agua del entorno del disolvente, extrayendo un grupo hidroxilo y reprotonando Glu 35 (Figura 43c y d).

5. La enzima libera entonces el residuo D con su polisacárido unido y la reacción se completa.

El mecanismo de Phillips para la catálisis de la lisozima, tal como se ha esbozado anteriormente, está respaldado por una serie de observaciones experimentales. En particular, la importancia de Glu 35 y Asp 52 en el proceso se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis dirigida al sitio (SDM). La SDM es una técnica muy poderosa para examinar el papel de los residuos de aminoácidos individuales en la función de una proteína y se discutirá en detalle en la sección 7.2. El SDM implica el uso de la tecnología del ADN recombinante para sustituir selectivamente el residuo de interés por un aminoácido diferente con propiedades críticamente distintas. La proteína resultante puede entonces someterse a pruebas funcionales, por ejemplo, con respecto a la unión de sustratos o a la actividad catalítica. Cuando se aplicó esta técnica a la lisozima para sustituir Glu 35 por un residuo de glutamina (Gln), la proteína resultante podía seguir uniendo el sustrato (aunque con menos fuerza) pero no tenía actividad catalítica. Por tanto, Glu 35 es esencial para la actividad catalítica de la lisozima. Cuando se sustituyó Asp 52 por un residuo de asparagina (Asn), la proteína mutante tenía menos del 5% de la actividad catalítica de la lisozima normal (tipo salvaje), a pesar de que la forma mutante tenía una afinidad dos veces mayor por el sustrato. De ello se deduce que Asp 52 es esencial para la actividad catalítica de la lisozima. Los experimentos realizados con agentes químicos que modificaron covalentemente estos residuos, sin afectar significativamente a la estructura de rayos X, demostraron igualmente que eran esenciales para la actividad catalítica.