Transporte de Cistina e Cistinosina
Cistina acumula-se dentro de lisossomas de leucócitos cistinóticos14 e fibroblastos.44 A cloroquina e outros inibidores da degradação da proteína lisossômica atenuam a re-acumulação da cistina em células cistinóticas esgotadas, indicando que a degradação da proteína intracelular é a fonte do excesso de cistina.45 O conteúdo de cistina nas células normais e cistinóticas também pode ser aumentado através da carga com dimetil éster de cistina46 ou dissulfeto misto de cisteína-glutatona44; notavelmente, no entanto, a saída de cistina dos lisossomos é acentuadamente prejudicada nas células cistinóticas carregadas de cistina.44,46 O efluxo de cistina a partir de células derivadas de portadores heterozigotos do gene da cistinose nefropática não é significativamente prejudicado quando comparado com células do tipo selvagem.44 Entretanto, a medida do contratransporte de cistina em grânulos lisossômicos demonstra claramente uma ausência em pacientes homozigotos, com valores para portadores heterozigotos que são aproximadamente metade dos das células de controle normais47; o transporte defeituoso de cistina lisossômica é, portanto, o defeito causador da cistinose.
O diagnóstico bioquímico tanto dos pacientes48 quanto dos portadores heterozigotos49 foi crítico para o mapeamento fino do gene da cistinose no cromossomo 17p13. Um avanço importante foi a detecção de deleções genômicas para um marcador microsatélite ligado, seguido pela identificação do gene CTNS dentro do intervalo mínimo de deleção.50 O gene CTNS compreende 12 exons, codificando uma proteína 367-aminoácida chamada cistinosina. A cistinosina consiste em sete domínios transmembrana, um terminal N de 128-aminoácido que contém sete sítios de glicosilação e um terminal C citosólico C de 10-aminoácidos. Todos os pacientes com os vários subtipos de cistinose parecem ter uma mutação no gene CTNS (ou seja, não há evidências até o momento de heterogeneidade genética). A mutação mais comum é uma deleção de 57kb que move a região de 5′ a montante do exon 1051,52; mais de 70% dos pacientes com cistinose nefropática de descendência do norte da Europa são homozigotos para essa mutação.52-54 Bendavid e colegas desenvolveram sondas de hibridização in situ fluorescentes para essa grande deleção, a primeira do gênero para um distúrbio de armazenamento lisossômico.55 Mutações de efeito fundador putativo separadas foram identificadas no Canadá francês56 (W138X, de origem irlandesa) e na província da Bretanha, na França57 (uma mutação de emenda no final do exon 8). Uma mutação falsa recorrente (G339R) foi identificada em duas populações étnicas particulares: duas famílias não relacionadas de descendência Amish-Mennonita e cinco famílias não relacionadas de origem judaico-marroquina.58-61 Uma outra 50 mutações de CTNS também foram identificadas, incluindo pelo menos três pacientes com mutações na região promotora do gene.62 Pacientes com cistinose juvenil ou ocular são homozigotos para uma mutação “mais branda”, tipicamente uma mutação pontual sem interrupção do quadro de leitura aberta; alternativamente, esses pacientes são heterozigotos compostos para uma mutação leve e uma mutação mais severa.17,59
Cistinosina é amplamente expressa, com transcrição particularmente abundante no pâncreas, músculo e rim.50 Imunohistoquímica com anticorpos anti-cistinosina63 e transfecção de células com DNA complementar marcado com epitope (cDNA)64,65 revela que a proteína é expressa em lisossomos. Como esperado, a expressão da cistinosina é particularmente robusta no túbulo proximal renal.63 A localização da cistinosina na membrana lisossômica é dependente tanto de um motivo de classificação lisossômica GYDQL à base de tirosina localizado na cauda terminal C quanto de um pentapéptido YFPQA dentro do quinto laço intertransmembrana. O motivo YFPQA é algo único, pois é um exemplo raro de um sinal de classificação lisossômica localizado fora da cauda citoplasmática.64 Parece exibir alguma capacidade de resgatar a classificação da cistinosina por si só, dado que a cistinosina mutante com um motivo GYDQL ausente, mas um motivo YFPQA intacto ainda se localiza parcialmente nos lisossomos.65 Uma minoria das mutações da cistinose afeta o alvo lisossômico da cistinose, devido à ruptura primária do motivo GYDQL ou a efeitos ainda não identificados na estrutura secundária.66
A caracterização funcional da cistinosina explorou o redirecionamento da proteína para a membrana plasmática em um mutante, a cistinosina GYDQL, que não possui o motivo GYDQL terminal C.67 Assim, a cistinosina GYDQL funciona como um transportador de cistina acionada por H+ na membrana plasmática das células transfectadas. É altamente específica para a cistina L; outros aminoácidos, em particular a cisteína monossulfídica, não são substratos. A cistina é saturável e segue a cinética de Michaelis-Menton, com um Km para a cistina de ∼280 μM.67 O transporte interno é estimulado consideravelmente por um pH extracelular ácido externo (Fig. 14-6); o colapso deste gradiente transmembrana H+ pela adição de nigericina elimina o transporte, consistente com o co-transporte de cistina H+ pela cistina. O transporte lisossômico da cistina depende da presença de trifosfato de adenosina (ATP), que alimenta o lisossômico H+-ATPase e aciona o efluxo da cistina (Fig. 14-7).46,68,69
A construção da cistina GYDQL tem sido utilizada para caracterização funcional de mutações de falta de sentido associadas à doença na cistinosina. Na sua maioria, o transporte e os fenótipos clínicos correlacionam-se, com a abolição do transporte por mutações associadas à cistinose nefropática e função residual mediada por construções que expressam mutações associadas a subtipos juvenis e oculares da doença.66 Entretanto, algumas mutações associadas à cistinose juvenil abolem o transporte no contexto da cistino-.GYDQL, sugerindo que essas mutações têm efeitos menores sobre a cistinose completa expressa em membranas lisossômicas; uma possibilidade é que a cistinose interaja com proteínas lisossômicas que estabilizam essas formas mutantes específicas.66 O inverso também ocorre, de modo que algumas mutações da cistinose nefropática têm efeito mínimo no transporte mediado pela cistino-.GYDQL.66
A eliminação da cistinose em ratos leva ao acúmulo de cistina em múltiplos órgãos, incluindo rim.70 O depósito focal de cristais de cistina pode ser detectado em vários tecidos, incluindo dentro das células do túbulo proximal. No entanto, estes ratos não apresentam uma tubulopatia proximal, o que sugere que o acúmulo de cristais de cistina por si só não é causador de doença.70 No entanto, as anomalias oculares em ratos com deficiência de cistina são muito semelhantes aos pacientes com cistinose. Estes animais assim desenvolvem depósitos de cristais de cistina córnea e manchas despigmentadas na retina, indicativo de uma retinopatia.70