1 Introducere
Plasarea și stabilitatea ARNt este crucială pentru o traducere eficientă, iar defectele în oricare dintre aceste proprietăți pot duce la cantități reduse de ARNt, ceea ce duce la defecte de creștere la drojdii și la boli la om (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). La drojdia Saccharomyces cerevisiae, există două căi majore de control al calității celulare cunoscute pentru a degrada speciile de ARNt defecte. Prima cale este calea de supraveghere nucleară, care acționează asupra pre-ARNt în nucleu prin utilizarea exosomului nuclear și a complexului TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) prin degradarea preARNiMet căruia îi lipsește modificarea m1A58 sau care are un trailer 3′ procesat greșit (Ozanick et al., 2009) și a unei fracțiuni de preARNt de tip sălbatic (WT) (Gudipati et al., 2012). A doua cale este calea de descompunere rapidă a ARNt (RTD), care degradează specii specifice de ARNt mature, hipomodificate sau destabilizate prin activitatea exonucleazelor 5′-3′ Rat1 și Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD este declanșată în mutanți cărora le lipsește oricare dintre mai multe modificări în corpul ARNt sau prin mutații destabilizatoare, iar pentru toți substraturile RTD identificate, suprimarea MET22 restabilește complet nivelurile de ARNt și creșterea (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Se presupune că suprimarea RTD în tulpinile met22Δ se datorează inhibării exonucleazelor Rat1 și Xrn1 de către metabolitul 3′-fosfoadenozină-5′-fosfat, care are niveluri crescute atunci când Met22 este inhibat (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).Se știe că
RTD acționează asupra mai multor specii specifice de ARNt, care au fost identificate și studiate folosind șapte abordări (Fig. 1). Prima abordare a fost aceea de a utiliza microarrays pentru a compara nivelurile de ARNt la scară genomică la nivelul întregului genom în mutanții de modificare sensibili la temperatură trm8Δ trm4Δ (lipsiți de m7G46 și m5C) și în tulpini înrudite în condiții semipermisive. În acest fel, am identificat substratul RTD tRNAVal(AAC), deoarece acesta a prezentat niveluri reduse de ARNt în mutantul trm8Δ trm4Δ în raport cu WT sau cu mutanții unici corespunzători (Alexandrov et al., 2006).
Figura 1. Diferite abordări utilizate pentru a identifica și analiza substraturile RTD.
În cea de-a doua abordare, au fost utilizate Northern Blots pentru a examina atât rata, cât și specificitatea degradării ARNt pentru substraturile RTD în mutanții de modificare sensibili la temperatură. În această abordare, ARN-ul izolat din celule la diferite momente de timp după modificarea temperaturii a fost analizat pentru nivelurile de ARNt specifici. În urma acestei analize, am constatat că 50% din tRNAVal(AAC) a fost degradat într-un mutant trm8Δ trm4Δ în decurs de 30 de minute de la o schimbare de la 28 la 37 °C, în timp ce tRNAiMet, tRNAMet și tRNAPhe hipomodificate în mod similar nu au prezentat nicio scădere (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Mai mult decât atât, nivelurile relative de ARNt încărcat și neîncărcat au putut fi măsurate prin efectuarea de northern blot în condiții acide, ceea ce a arătat că nivelurile de tRNAVal(AAC) încărcat au fost reduse cu 50% în decurs de 25 de minute de la schimbarea de temperatură într-un mutant trm8Δ trm4Δ și că nivelurile de tRNAVal(AAC) neîncărcat păreau neafectate (Alexandrov et al, 2006).
Cea de-a treia abordare a fost prin suprimarea ARNt de înaltă copiere, în care o plasmidă de înaltă copiere care exprimă un anumit ARNt a fost introdusă într-un mutant de modificare a ARNt sensibil la temperatură. În cazul în care ARNt era un substrat RTD și sensibilitatea la temperatură era rezultatul degradării unei singure specii de ARNt, atunci supraexprimarea ARNt ar suprima defectul. Astfel, am constatat că sensibilitatea la temperatură a unui mutant trm8Δ trm4Δ a fost suprimată de o plasmidă de înaltă copiere care exprimă tRNAVal(AAC), ceea ce indică faptul că sensibilitatea la temperatură se datorează în primul rând pierderii tRNAVal(AAC) și că modificările lipsă sunt importante pentru stabilitatea tRNA (Alexandrov et al., 2006). În mod similar, substraturile RTD ale câtorva alți mutanți de modificare a ARNt au fost, de asemenea, identificate folosind această abordare, inclusiv tRNASer(CGA) și tRNASer(UGA) în mutanții tan1Δ trm44Δ (lipsiți de ac4C12 și Um44) și în mutanții trm1Δ trm4Δ (lipsiți de m2,2G26 și m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).
În al patrulea rând, am utilizat o abordare de înlocuire genetică pentru a identifica factorii determinanți ai RTD în familia tRNASer prin înlocuirea genei unice esențiale tRNASer(CGA) (SUP61) cu diferite variante tRNASer(CGA) în tulpina WT și met22Δ și apoi testarea creșterii la diferite temperaturi. Folosind această abordare, am determinat că stabilitățile combinate ale acceptorului și ale tulpinii T au fost factori determinanți puternici pentru sensibilitatea la RTD în familia de gene tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Această concluzie a fost susținută în continuare de o a cincea abordare pentru măsurarea RTD, în care am arătat in vitro că variantele tRNASer(CGA) lipsite de ac4C12 și Um44, sau cu mutații destabilizatoare în tulpina acceptoare, au fost mai predispuse la digestia de către Xrn1 și mai sensibile la eliminarea fosfatului 5′ de către fosfataza intestinală de vițel (Whipple et al, 2011).
În această trecere în revistă, vom discuta despre a șasea și a șaptea abordare pe care am dezvoltat-o recent pentru studiul substraturilor RTD, care s-au dovedit extrem de valoroase în extinderea înțelegerii noastre asupra căii RTD. Cea de-a șasea abordare utilizează un reporter fluorescent pentru a analiza în mod cuprinzător biblioteci de mii de variante de ARNt în tulpinile WT și met22Δ. Prin această abordare, am identificat 643 de candidați susceptibili de a fi substrat RTD, mulți în regiuni care nu se așteptau să declanșeze RTD pe baza lucrărilor anterioare (Guy et al., 2014). Vom prezenta date care demonstrează că această abordare poate fi utilizată pentru a studia funcția ARNt în diferite condiții și vom discuta despre alte aplicații ale abordării.
Cea de-a șaptea abordare utilizează extinderea amorselor otrăvite pentru a măsura nivelurile de ARNt într-o tulpină WT și met22Δ și este valoroasă prin capacitatea sa de a măsura în mod specific o variantă de ARNt chiar și în prezența ARNt WT, a cărui secvență poate diferi doar cu un singur reziduu. Prezentăm o metodologie detaliată a acestei abordări și discutăm unele dintre celelalte aplicații posibile ale acesteia.