Transportul de cistină și cistinosina
Cistina se acumulează în lizozomii leucocitelor cistinotice14 și a fibroblastelor.44 Clorochina și alți inhibitori ai degradării proteinelor lizozomale atenuează reacumularea de cistină în celulele cistinotice epuizate, indicând că degradarea proteinelor intracelulare este sursa excesului de cistină.45 Conținutul de cistină al celulelor normale și cistinotice poate fi, de asemenea, crescut prin încărcarea cu ester dimetilic de cistină46 sau disulfură mixtă de cisteină-glutation44; cu toate acestea, în special, ieșirea cistinei din lizozomi este semnificativ afectată în celulele cistinotice încărcate cu cistină.44,46 Efectul de cistină din celulele derivate din purtătorii heterozigoți ai genei cistinozei nefropatice nu este semnificativ afectat în comparație cu celulele de tip sălbatic.44 Cu toate acestea, măsurarea contratransportului cistină-cistină în granulele lizozomiale demonstrează în mod clar o absență la pacienții homozigoți, cu valori pentru purtătorii heterozigoți care sunt de aproximativ jumătate din cele ale celulelor normale de control47; transportul defectuos al cistinei lizozomiale este astfel defectul cauzal în cistinoză.
Diagnosticul biochimic atât al pacienților48 cât și al purtătorilor heterozigoți49 a fost esențial pentru cartografierea fină a genei cistinozei pe cromozomul 17p13. O descoperire esențială a fost detectarea delețiilor genomice pentru un marker microsatelit legat, urmată de identificarea genei CTNS în cadrul intervalului minim de deleție.50 Gena CTNS cuprinde 12 exoni, care codifică o proteină de 367 de aminoacizi numită cistinosină. Cistinosina este formată din șapte domenii transmembranare, o extremitate N de 128 de aminoacizi care conține șapte situsuri de glicozilare și o extremitate C citosolică de 10 aminoacizi. Toți pacienții cu diferitele subtipuri de cistinoză par să aibă o mutație în gena CTNS (adică, până în prezent, nu există dovezi de eterogenitate genetică). Cea mai frecventă mutație este o deleție de 57-kb care mută regiunea 5′ în amonte de exonul 1051,52; peste 70% dintre pacienții cu cistinoză nefropatică de origine nord-europeană sunt homozigoți pentru această mutație52.-54 Bendavid și colegii săi au dezvoltat sonde de hibridizare fluorescentă in situ pentru această deleție mare, prima de acest tip pentru o tulburare de stocare lizozomală.55 Mutații separate cu efect fondator putativ au fost identificate în Canada franceză56 (W138X, de origine irlandeză) și în provincia Bretagne din Franța57 (o mutație de tip splice-site la sfârșitul exonului 8). O mutație recurentă de tip missense (G339R) a fost identificată în două populații etnice particulare: două familii neînrudite de origine amish-menonită și cinci familii neînrudite de origine evreiască-marocană.58-61 Au fost identificate, de asemenea, alte 50 de mutații ale CTNS, inclusiv cel puțin trei pacienți cu mutații în regiunea promotoare a genei.62 Pacienții cu cistinoză juvenilă sau oculară sunt homozigoți pentru o mutație „mai ușoară”, de obicei o mutație punctiformă fără întrerupere a cadrului de citire deschis; alternativ, acești pacienți sunt heterozigoți compuși pentru o mutație ușoară și o mutație mai severă.17,59
Cistinosina este exprimată pe scară largă, cu o transcriere deosebit de abundentă în pancreas, mușchi și rinichi.50 Imunohistochimia cu anticorpi anticistinosină63 și transfecția celulelor cu ADN complementar (ADNc)64,65 marcat cu epitopi relevă faptul că proteina este exprimată în lizozomi. După cum era de așteptat, expresia cistinosinei este deosebit de robustă în tubulii proximali renali.63 Localizarea cistinosinei în membrana lizozomală se bazează atât pe un motiv de sortare lizozomală GYDQL bazat pe tirozină, situat pe coada C-terminală, cât și pe o pentapeptidă YFPQA din cadrul celei de-a cincea bucle inter-transmembranare. Motivul YFPQA este oarecum unic prin faptul că este un exemplu rar de semnal de sortare lizozomală situat în afara cozii citoplasmatice.64 Acesta pare să prezinte o anumită capacitate de a salva sortarea cistinosinei pe cont propriu, având în vedere că un mutant de cistinosină cu un motiv GYDQL absent, dar cu un motiv YFPQA intact, încă se localizează parțial în lizozomi.65 O minoritate de mutații de cistinoză afectează direcționarea lizozomală a cistinosinei, din cauza întreruperii primare a motivului GYDQL sau a unor efecte încă necaracterizate asupra structurii secundare.66
Caracterizarea funcțională a cistinosinei a exploatat redirecționarea proteinei către membrana plasmatică într-un mutant, cystinosin-.GYDQL, căruia îi lipsește motivul GYDQL C-terminal.67 Cystinosin-.GYDQL funcționează astfel ca un transportor de cistină condus de H+ la nivelul membranei plasmatice a celulelor transfectate. Este foarte specific pentru L-cistină; alți aminoacizi, în special monosulfura de cisteină, nu sunt substraturi. Cistinosina este saturabilă și urmează cinetica Michaelis-Menton, cu un Km pentru cistină de ∼280 μM.67 Transportul intern este stimulat considerabil de un pH extracelular acid-extern (Fig. 14-6); prăbușirea acestui gradient transmembranar de H+ prin adăugarea de nigericină abolește transportul, în concordanță cu cotransportul H+-cistină de către cistinosină. Transportul lizozomal de cistină depinde, la rândul său, de prezența adenozin trifosfatului (ATP), care alimentează H+-ATPază lizozomală și conduce efluxul de cistină (Fig. 14-7).46,68,69
Construcția cystinosin-.GYDQL a fost utilizată pentru caracterizarea funcțională a mutațiilor missense asociate cu boli în cystinosin. În cea mai mare parte, transportul și fenotipurile clinice sunt corelate, cu abolirea transportului de către mutațiile asociate cu cistinoza nefropatică și funcția reziduală mediată de constructele care exprimă mutațiile asociate cu subtipurile juvenile și oculare ale bolii.66 Cu toate acestea, unele mutații asociate cu cistinoza juvenilă abolesc transportul în contextul cistinosinei-.GYDQL, sugerând că aceste mutații au efecte mai mici asupra cistinosinei de lungime completă exprimată în membranele lizozomale; o posibilitate este că cistinosina interacționează cu proteinele lizozomale care stabilizează aceste forme mutante particulare.66 Se întâmplă și invers, astfel încât unele mutații de cistinoză nefropatică au un efect minim asupra transportului mediat de cistinosina-.GYDQL.66
Deleția țintită a cistinosinei la șoareci duce la acumularea de cistină în mai multe organe, inclusiv în rinichi.70 Depunerea focală de cristale de cistină poate fi detectată în mai multe țesuturi, inclusiv în interiorul celulelor tubulare proximale. Cu toate acestea, acești șoareci nu prezintă o tubulopatie proximală, ceea ce sugerează că acumularea de cristale de cistină nu este în sine cauza bolii.70 Cu toate acestea, anomaliile oculare la șoarecii cu deficit de cistinosină sunt foarte asemănătoare cu cele ale pacienților cu cistinoză. Astfel, aceste animale dezvoltă depozite de cristale de cistină la nivelul corneei și pete depigmentate în retină, ceea ce indică o retinopatie.70
.