Co-cultură bacteriană cu traducător de semnalizare celulară și module de control al creșterii pentru reglarea autonomă a compoziției culturii

Rata de creștere celulară controlată de semnalul IA-1

Am testat mai întâi controlul ratei de creștere celulară a E. coli prin reglarea transcripțională a ptsH, o genă implicată în transportul zahărului. HPr (codificată de ptsH) este recunoscută pe scară largă ca fiind una dintre o serie de proteine (de exemplu, E1, HPr, EII) care transferă secvențial o grupare fosforil de la fosfoenolpiruvat (PEP) la glucoză (sau alt carbohidrat PTS)34. HPr este foarte bine conservat37. Am descoperit recent că HPr interacționează cu kinaza AI-2 LsrK, influențând absorbția AI-235. Am valorificat funcționalitatea de modulare a AI-2 mai târziu, atunci când am construit celula de detectare a AI-2. Aici, am demonstrat că tulpinile mutante ptsH cresc mai lent decât tulpinile de tip sălbatic în medii minime care conțin glucoză (Fig. suplimentară 1a). Atunci când ptsH a fost plasat sub un promotor indus de IPTG într-un mutant ptsH, rata de creștere a putut fi controlată pe baza adaosului de IPTG (Fig. Suplimentară 1b). În mod important, am demonstrat că inducerea expresiei ptsH duce la o creștere a ratei de creștere a celulelor. La fel de important, acest comportament este indiferent dacă mediul conține sau nu glucoză ca sursă principală de carbon (Fig. Suplimentară 1c).

Bazându-ne pe această dovadă de concept, am proiectat în continuare o rată de creștere controlată de semnalul QS. Pentru a construi tulpina de control, ptsH a fost plasat sub controlul promotorului QS AI-1 lasI QS pe plasmidul pAHL-HPr (Fig. 2a) într-o tulpină ptsH mutantă PH04. În altă parte pe plasmidă, atât dsRedExpress2, pentru vizualizarea celulelor, cât și LasR, necesar pentru activarea promotorului lasI, au fost exprimate sub un promotor constitutiv T5. Adăugarea de AI-1 la tulpina de control a crescut rata de creștere celulară de până la 1,8 ori față de rata de creștere inițială, într-o manieră dependentă de doză (Fig. 2b). Rata de creștere specifică măsurată (între 1 și 4 h după adăugarea de AI-1) a servit drept bază pentru un model de tip Monod al ratei de creștere bazat pe nivelul de AI-1 (Fig. 2c).

AI-1 modulează compoziția în co-culturile de celule controler

Celele controler reglementate de AI-1 au fost apoi co-culturizate cu alte tulpini pentru a verifica dacă adăugarea de AI-1 a modificat compoziția co-culturii. Celulele de control al creșterii care exprimă o proteină fluorescentă roșie (PH04 pAHL-ptsH) au fost co-cultivate fie cu PH04 pCT6, fie cu TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 are o rată de creștere de bază similară cu PH04 pAHL-ptsH, în timp ce TOP10 pT5G crește semnificativ mai repede. Culturile au fost inoculate la densități celulare aproximativ egale și au fost suplimentate cu niveluri variate de AI-1. După 8 h, probele au fost prelevate pentru analiză prin microscopie cu fluorescență și cuantificate cu ajutorul ImageJ. Așa cum era de așteptat, atunci când celulele de control au fost cultivate cu PH04, compoziția culturii de celule de control a crescut odată cu creșterea concentrației de AI-1 (Fig. 3a). O tendință similară a fost observată atunci când celulele au fost cultivate cu TOP10, în ciuda ratei de creștere mai rapide a TOP10 (Fig. 3b). Adică, în co-culturile fără AI-1, fracțiunea de celule de control în co-culturile TOP10 a scăzut de fapt semnificativ de la ~0,5 inițial la ~0,09 în cele 8 ore care au urmat. Adăugarea de AI-1 a contracarat această diferență de viteză de creștere și a dus la un nivel mai mare de celule de control în aceeași perioadă de 8 ore. Aceste rezultate demonstrează că, indiferent de alte tulpini din cultură și de ratele de creștere ale acestora, AI-1 (care nu este o moleculă de semnalizare QS a E. coli) modulează rata de creștere a tulpinii de control modificat, iar modificarea a avut loc suficient de rapid pentru a permite o schimbare observabilă în compoziția culturii – în special chiar și în condiții de lot pe termen relativ scurt (spre deosebire de culturile de loturi alimentate, de loturi repetate sau de culturi continue).

În continuare, tulpina controlată de regulator AI-1 a fost coloculată cu celule care produc AI-1 atunci când este indusă. PH04 pSox-LasI și PH04 pAHL-HPr au fost co-cultivate împreună. Plasmidul pSox-LasI conține lasI, care sintetizează AI-1, sub promotor soxS7 , care poate fi indus de piocianină. În acest experiment, tulpina controlată primește un semnal de la o tulpină traducătoare care, la rândul ei, a produs AI-1 ca răspuns la piocianină. În acest fel, se demonstrează că schema de control al culturii comune răspunde la un anumit indiciu molecular. Aici, fiecare cultură a fost inoculată la densități inițiale aproximativ egale, iar co-culturile au fost expuse sau nu la piocianină. Culturile expuse au prezentat o producție crescută de AI-1 și o compoziție crescută corespunzătoare de PH04 pAHL-HPr în decurs de 5 ore (Fig. 3c). Aceste rezultate demonstrează că AI-1 produsă de o tulpină alternativă poate modula rata de creștere a tulpinii de control și că acest lucru se poate întâmpla la intervalele de timp necesare pentru a afecta schimbarea într-un proces discontinuu. În plus, acest lucru demonstrează fezabilitatea potențială a unei co-culturi reglementate de utilizator, bazată pe o aplicație specifică utilizatorului a unei molecule sau a unui inductor, în acest caz piocianina. În continuare, am modificat tulpina translator pentru a crea o coprocultura reglată în mod autonom pe baza moleculei omniprezente de semnalizare AI-2.

Design of AI-2 sensing translator cells

Pentru a construi linii celulare care detectează AI-2 și produc AI-1, am modificat tulpini pentru a activa expresia LasI, care sintetizează AI-1, atunci când promotorul AI-2 lsr este activat. Am folosit un sistem cu două plasmide pentru a amplifica expresia de la promotorul lsr slab25 (Fig. 4a). Pe scurt, AI-2 este fosforilat de LsrK și AI-2 fosforilat ameliorează reprimarea promotorului de către LsrR, crescând transcripția genelor transportoare lsr și accelerând absorbția de AI-2. În același timp, activarea AI-2 mediată de AI-2 a promotorului lsr are ca rezultat transcrierea ARN polimerazei T7 din plasmidă pCT6 și transcrierea ulterioară a lasI din plasmidă pET-LasI.

Sistemul a fost construit pentru prima dată în tulpina gazdă E. coli CT104, care este un mutant luxS (de exemplu, incapabil să producă AI-2). CT104 este, de asemenea, lipsit de lsrFG, responsabil pentru degradarea semnalului AI-2 fosforilat, crescând sensibilitatea celulei la AI-238. Am verificat că această linie celulară, CT104 pCT6 pET-LasI, a produs AI-1 atunci când a fost cultivată în medii condiționate (CM) din BL21 producătoare de AI-2 (figura suplimentară 2). BL21 au fost cultivate la diferite densități de celule, CM a fost colectat, iar celulele CT104 au fost cultivate în CM colectat. Este important de remarcat faptul că AI-1 produsă de celulele CT104 a fost corelată cu densitatea celulelor BL21 producătoare de AI-2 (figura suplimentară 2a). Am testat, de asemenea, dacă celulele translator adăugate la consorții cu diferite fracțiuni de celule producătoare de AI-2 ar putea produce semnalul AI-1 în funcție de compoziția consorțiului. Celulele CT104 au fost adăugate la culturi cu diferite proporții de BL21 (luxS+) și BL21 ΔluxS. După 6 h, nivelul semnalului AI-1 în mediul extracelular a fost indicativ pentru compoziția culturii, care, la rândul său, se bazează în principal pe fracția inițială de celule luxS+25 (Fig. suplimentară 2b).

Experimentele de mai sus au demonstrat că se poate construi o linie celulară care să producă AI-1 ca răspuns la AI-2 din celule producătoare de AI-2. Aceste experimente au fost efectuate în mediu LB și nu în mediu cu glucoză. Prezența glucozei inhibă absorbția AI-2 și activitatea promotorului lsr39 , iar utilizarea celulelor CT104 ar putea fi potențial limitată la medii fără glucoză (a se vedea figura suplimentară 3 pentru schema căii AI-2 QS). Pe baza cunoștințelor despre sistemul AI-2 QS, am încercat să construim o tulpină care să fie capabilă să asimileze AI-2 și să activeze promotorul lsr în medii care conțin glucoză. În acest fel, rezultatele noastre ar putea fi aplicate în mod mai general. Anterior, am demonstrat că HPr (codificat de ptsH) interacționează cu LsrK, inhibând activitatea LsrK kinazei, și că s-a demonstrat că mutanții ptsH absorb AI-2 chiar și în medii care conțin glucoză35. Prin urmare, am emis ipoteza că utilizarea PH04 (ΔptsH ΔluxS) ca tulpină gazdă ar permite producerea de AI-1 pe bază de AI-2 în medii care conțin glucoză. Am testat celulele traducătoare folosind ambele tulpini gazdă în medii LB și M9 cu glucoză, cu și fără AI-2. Nivelul de AI-1 produs a depins de adăugarea de AI-2, dar și de tulpina gazdă și de mediu (Fig. 4b). Ambele tulpini au produs AI-1 atunci când celulele au fost adăugate în mediul LB cu AI-2. După cum era de așteptat, în mediul M9, utilizarea tulpinii gazdă CT104 a dus la o schimbare de ori mică sau nesemnificativă a activității AI-1 atunci când se compară culturile cu și fără AI-2. Cu toate acestea, este important de remarcat faptul că celulele translatoare PH04 au prezentat totuși o producție de AI-1 activată de AI-2 în medii M9 + glucoză. În acest fel, sistemul modificat ar putea fi utilizat în medii care conțin glucoză.

Caracterizarea celulelor translatoare PH04

Celele translatoare PH04 absorb molecula semnal AI-2, transduc semnalul prin activarea expresiei LasI și sintetizează și secretă AI-1. Ieșirea AI-1 dorită este apoi o funcție de intrarea AI-2. Am caracterizat producția de AI-1 semnalată de AI-2 în tulpina traducătoare PH04 în timp și pentru o gamă de concentrații de AI-2 relevante din punct de vedere biologic. S-a constatat că rata de producere a AI-1 de către celulele PH04 translator este dependentă de doza de AI-2 (Fig. 5a). Observăm că, în aceste condiții și în condiții similare, AI-2 este consumat în cea mai mare parte în decurs de 4 ore (Fig. 5b). Adăugarea de AI-2 sau producția de AI-1 pe bază de AI-2 în aceste culturi discontinue nu a dus la o scădere observabilă a creșterii celulelor (Fig. 5c). Am caracterizat apoi rata de producție de AI-1 pe bază de celule în timp pentru fiecare concentrație de AI-2 testată prin trasarea unei funcții logistice prin datele privind AI-1, determinarea derivatei acestei ecuații în timp și împărțirea derivatei la densitatea celulară în timp (tabelul suplimentar 1), obținând o rată de producție specifică în funcție de timp. Graficele rezultate (Fig. 5d) arată rata estimată pe celulă a producției de AI-1 în funcție de AI-2 adăugat și de timpul scurs de la adăugarea de AI-2. După cum se va arăta mai târziu, acest lucru se aliniază cu o observație subiacentă pe care am observat-o, și anume că traiectoria expresiei genice ca răspuns la un indiciu inițial este destul de robustă21,38,40.

În continuare, a fost testat efectul AI-1 produs de celulele translatoare PH04 asupra ratei de creștere a celulelor controler sensibile la AI-1. Adică, celulele sensibile la creștere au fost adăugate la CM care conținea AI-1 de la celulele traducătoare care fuseseră expuse la diferite niveluri de AI-2 și au fost cultivate timp de ~3 h (Fig. suplimentară 4a). Dincolo de ceea ce s-a arătat în Fig. 5, unde AI-1 este generat de expunerea directă la AI-2, acest experiment demonstrează că traducerea celulară a AI-2 în AI-1 se poate face cu expresia și dinamica de cultură celulară necesare astfel încât să influențeze rata de creștere a celei de-a doua populații (Fig. suplimentară 4b). Observăm, de asemenea, că s-a demonstrat că rata de creștere dinamică a celulelor de control a scăzut în timp pe parcursul celor 3 ore care au urmat. Această observație a devenit mai dramatică în experimentele ulterioare de co-cultură.

Reglarea autonomă a compoziției co-culturii

În continuare, am adăugat celulele traducătoare (denumite populația A) și celulele de control care răspund la AI-1 (populația B) în soluții având o gamă de concentrații inițiale de AI-2. În culturile mixte de celule traducătoare și de celule de control, celulele traducătoare reglează în mod autonom compoziția consorțiului pe baza nivelului inițial de AI-2. În figura suplimentară 5, culturile comune cu niveluri inițiale crescute de AI-2 au dus la o creștere a AI-1 (figura suplimentară 5b) și la o creștere corespunzătoare a abundenței relative a populației B (figura suplimentară 5a). Aceste rezultate au demonstrat conceptul de control autonom mediat de semnal al populației consorțiului. Este important de remarcat faptul că estimările ratei de creștere pentru Populația A și Populația B au fost în concordanță cu valorile așteptate ale ratei de creștere măsurate în timpul experimentelor de monocultură (Fig. Suplimentară 5c).

Apoi, după ce am demonstrat că celulele translatoare pot regla compoziția consorțiilor pe baza expunerii la AI-2, am dezvoltat un model matematic pentru a caracteriza dinamica sistemului. În acest fel, se poate prezice comportamentul de co-cultivare având în vedere condiții inițiale specifice, modele de rată de creștere etc., pentru a determina parametrii necesari pentru a viza un rezultat dorit. Acest model matematic simplu din punct de vedere conceptual a fost creat pentru a prezice comportamentul de coprocultură folosind date de la tulpinile individuale. Modelul constă în patru ecuații diferențiale ordinare, câte una pentru fiecare densitate a populației, concentrație de substrat și concentrație de AI-1 (tabelele suplimentare 2 și 3). Cinetica de creștere Monod cu un coeficient de randament constant a fost utilizată pentru a modela creșterea celulară și concentrația de substrat, cu funcții suplimentare care țin cont de producția și/sau efectele moleculelor QS. AI-1 produsă de populația A se bazează atât pe nivelul de expunere la AI-2, cât și pe timp (fAI1). În lucrarea anterioară38, am constatat că traiectoriile dependente de timp ale comportamentului celular au fost o consecință a expunerii inițiale la autoinducător, astfel încât funcțiile dependente de timp ale producției de AI-1 ar fi plauzibile aici. Rata de creștere a populației B a fost formulată pe baza nivelului predominant de AI-1 (fHPr). Ratele de creștere specifice maxime au fost măsurate pe baza datelor experimentale, randamentele au fost estimate pe baza densității fazei staționare observate experimental și a concentrațiilor inițiale cunoscute de substrat, iar valorile K1 și K2 au fost alese pe baza valorilor din literatura de specialitate pentru glucoză. Solverul ode45 din MATLAB (versiunea R2016a) a fost utilizat pentru a rezolva sistemul de ODE-uri. Modelul poate fi utilizat pentru a arăta modul în care se preconizează că o populație de coprocultură se va modifica în timp, având în vedere aceste ecuații de viteză fenomenologice simple și constantele cele mai bine adaptate. După cum s-a menționat, acest lucru oferă baza pentru a determina dacă se poate prevedea că o coprocultura va evolua în timpul limitat disponibil într-o cultură discontinuă. Este important faptul că rezultatele noastre din monoculturi sunt folosite pentru a simula rezultatele experimentale din co-culturi.

Acest lucru înseamnă că, în continuare, am evaluat controlul co-culturii programat în mod autonom prin intermediul predicțiilor modelului. Co-culturi ale populațiilor A și B au fost plasate împreună pentru o gamă de populații inițiale de celule și au fost apoi adăugate în medii cu niveluri prescrise de AI-2 pentru a pune în mișcare o traiectorie a populației. În sistemul nostru, compoziția inițială este selectată pe baza raportului de celule furnizate în coprocultura și apoi compoziția culturii este ajustată în mod autonom în timp pe baza nivelului de AI-2 din mediu. Am comparat rezultatele cu modelul nostru. În Fig. 6, este prezentată compoziția co-culturii și nivelul de AI-1 după 5 h pentru o varietate de condiții, inclusiv variația raportului inițial A:B și a nivelului de AI-2. În aceste teste, am utilizat o singură densitate celulară a populației inițiale. Este important de remarcat faptul că am constatat că modelul nostru a prezis bine rezultatele experimentale, atât în ceea ce privește nivelul AI-1, cât și compoziția co-culturii. Observăm, de asemenea, că modelul poate fi utilizat pentru a selecta condițiile inițiale care dau un rezultat dorit. De exemplu, pentru a viza o populație B cu o densitate celulară relativă de 55% la 5 h, coprocultura ar putea fi inițiată cu un raport inițial A:B de 60:40 și o concentrație de AI-2 de 40 µM. Au fost testate și validate și alte scenarii, după cum este ilustrat. Aceste rezultate demonstrează în mod clar că atât condiția inițială a compoziției celulare (de exemplu, raportul A:B), cât și expunerea la diferite niveluri de AI-2 influențează traiectoria populației din coprocultură. Cu toate acestea, la fel de important este faptul că molecula de semnal ortogonal, AI-1, s-a comportat așa cum a fost modelată. Anticipăm că, prin extensie, includerea acestui semnal și a altor semnale traductoare va permite proiectarea și/sau controlul unor consorții suplimentare, variate sau mai complicate.

Atât, am testat sistemul de control al co-culturii prin expunerea la o concentrație de AI-2, 80 µM, care a fost mai mare decât concentrațiile de AI-2 utilizate pentru a caracteriza celulele traducătoare și pentru care nu aveam un model. Am folosit rezultatele co-culturii (Fig. 6) pentru a estima comportamentul celulelor translatoare într-o monocultură la această concentrație de AI-2. Am efectuat apoi experimente de monocultură adăugând 80 µM AI-2 la celulele translatoare și am arătat că am fost capabili să prezicem comportamentul în monocultură folosind datele din co-cultură și modelul. În figura suplimentară 6a este prezentată rata de producere a AI-1 prezisă de datele de coprocultură și de model (linie) și rata reală de producere a AI-1 în timpul experimentului de monocultură (puncte de date). Fig. suplimentară 6b prezintă nivelurile de AI-1 preconizate în monocultură de-a lungul timpului în comparație cu nivelurile reale de AI-1 măsurate. Nivelul previzionat de AI-1 a fost determinat cu ajutorul modelului, introducând rata estimată de producție de AI-1 și densitatea celulară inițială a monoculturii.

În cele din urmă, am testat sistemul nostru de colocultură pe o perioadă de timp mai îndelungată, folosind hrănirea repetată a loturilor cu adaosuri multiple de AI-2 (Fig. 7). Aici, obiectivul nostru a fost să extindem traiectoria populației dincolo de cea obținută prin variația compoziției inițiale și a expunerii la un nivel fix de AI-2 într-o cultură discontinuă simplă. În acest fel, am testat robustețea schemei de control. De exemplu, în Fig. 6, pentru culturile aflate inițial la ~40% din populația B, am constatat că am putut obține doar niveluri ale populației B care se apropiau de 60% și numai prin expunerea la niveluri ridicate (>80 μM) de AI-2. Prin testarea unui sistem de loturi repetate, am crezut că am putea conduce populația B la peste 80% prin simpla resuspendare și prelungirea sistemului în timp. Am adăugat co-cultura noastră în medii cu niveluri variate de AI-2 și la fiecare 3 ore am resuspendat celulele în medii proaspete cu AI-2 suplimentar. Imediat înainte de fiecare resuspensie, au fost prelevate probe pentru analiza concentrației de AI-1 și a compoziției culturii celulare (Fig. 7a, b). S-a măsurat, de asemenea, densitatea celulară și activitatea AI-2 (Fig. suplimentară 7). Am constatat că, în această configurație experimentală mai complexă, sistemul a funcționat, în general, așa cum a fost proiectat. Am constatat că, prin expunerea la cantități mai mici de AI-2 (20 și 40 μM), am putut atinge aproape 80 % din populația B. Cu toate acestea, în timpul acestui test, am constatat că rezultatele noastre experimentale au fost divergente față de rezultatele prevăzute de modelul nostru matematic. Am analizat mai atent cantitatea de AI-1 produsă și rata de creștere a culturilor în timpul fiecărui segment de 3 h pentru a înțelege dinamica culturii pe baza divergenței observate față de modelul simplu. De exemplu, AI-1 produsă în timpul celui de-al doilea și al treilea ciclu de 3 ore a fost mai mare decât cea prezisă de model. Privind retrospectiv, acest lucru a avut sens deoarece celulele, după primul ciclu de lot, au produs deja LasI (care sintetizează AI-1), iar AI-2 suplimentar a indus probabil o producție suplimentară de LasI (nu am inclus o etichetă de degradare pe LasI, astfel încât menținerea sa ar fi trebuit să fie anticipată). Am ajustat apoi modelul astfel încât rata de producție de AI-1 la începutul fiecărei resuspendări ulterioare în medii noi să fie aceeași cu cea de la sfârșitul ciclului anterior (Fig. 7c, linii continue). Încorporarea acestor noi funcții pentru producția de AI-1 în model a avut ca rezultat valori pentru AI-1 care se potrivesc foarte bine cu datele experimentale privind AI-1 (Fig. 7a, modelul în linii continue). În mod similar, am estimat rata de creștere a celulelor de control (a se vedea Nota suplimentară 1) și am constatat că rata de creștere în combinație cu concentrațiile de AI-1 nu se potrivea funcției noastre anterioare fAI1 (Fig. 7d). Menționăm că, pentru a calcula rata de creștere a celulelor controlorilor, am presupus că rata de creștere a celulelor translatoare a rămas constantă, deși este posibil ca acestea să fi scăzut ușor ca urmare a adăugărilor repetate de AI-2. În timp ce rata de creștere a regulatorului părea să crească inițial în funcție de AI-1, odată cu resuspendările ulterioare în medii proaspete, rata de creștere globală a scăzut. Am observat anterior o scădere dinamică a ratei de creștere la supraexprimarea HPr și LasI (figurile suplimentare 4 și 5). În acest caz, bănuim că fie o sarcină metabolică impusă celulelor prin expunerea repetată la niveluri ridicate de AI-1, fie niveluri reduse de substrat sau de nutrienți ar fi putut fi cauza scăderii creșterii în timpul ciclurilor ulterioare. Este important faptul că, prin ajustarea modelului nostru astfel încât efectul AI-1 asupra ratei de creștere să scadă în timp (a se vedea Nota suplimentară 2), am reușit să ne potrivim datele noastre experimentale (Fig. 7b, modelul ajustat în linii continue) fără a adăuga complexitate modelului.

În concluzie, sistemul nostru de coprocultură a răspuns așa cum a fost proiectat, indiferent dacă a fost plasat în medii fără AI-2 sau cu un nivel ridicat de AI-2. Mai mult, rezultatele noastre au arătat densități de populație controlabile care au cuprins între 40 și 80 % din celulele de control. De asemenea, comparația cu modelul nostru original a oferit o perspectivă asupra modului în care sistemul s-a comportat în această configurație experimentală mai complexă; celulele traducătoare păreau să producă niveluri mai ridicate de AI-1 în timp, în timp ce celulele controler păreau să aibă modificări reduse ale ratei de creștere reglementate de AI-1 în timp.

În cele din urmă, modelul ar putea oferi o bază pentru a explora in silico modul în care strategiile utilizate aici pentru culturile reglementate în mod autonom (marcate de rata de creștere reglementată de semnal și de semnalizarea nativă celulă-celulă) ar putea fi extinse la alte sisteme, inclusiv la sistemele reglementate de utilizator sau programabile care ar putea fi controlate în mod dinamic. De exemplu, culturile în chemostat se disting de sistemul autonom actual prin faptul că ieșirile lor sunt dirijate de intrările specificate de utilizator, cum ar fi rata de diluție. Ca o primă trecere, am efectuat simulări ale culturilor în comun crescute în chemostat prin adăugarea termenilor standard de flux la modelul discontinuu (figura suplimentară 8, tabelele suplimentare 4 și 5). Am constatat, în unele cazuri, că rata de diluție definește o compoziție a culturii în stare de echilibru care, la rândul său, poate fi ulterior „reglată” într-un interval constrâns de rata de diluție. „Reglarea” poate fi realizată prin modularea externă a semnalizării celulă-celulă, de exemplu, prin adăugarea exogenă de molecule de semnal. Aceste cazuri ilustrează modul în care interacțiunea dintre sistemul nostru autonom și alte sisteme controlate de utilizator ar putea conduce la traiectorii mai complexe ale populației. Rezultatele simulării noastre de aici servesc drept cadru conceptual pentru controlul compoziției consorțiilor în sisteme mai complexe, ghidate de utilizator. Discuții suplimentare privind simulările chemostatului se găsesc în Nota suplimentară 3.

.