Elisabeta s-a căsătorit cu Filip al II-lea al Spaniei, fiul lui Carol al V-lea, Împăratul Sfântului Imperiu Roman, și al Isabelei de Portugalia, în 1559. Inițial căsătorită prin procură la Notre Dame (cu Ducele de Alba în locul lui Filip) înainte de a părăsi Franța, ceremonia efectivă a avut loc în Guadalajara, Spania, la sosirea ei. Căsătoria a fost un rezultat al Păcii de la Cateau Cambrésis (1559). Cea de-a doua soție a sa, Maria I a Angliei, murise recent, ceea ce a făcut ca Elisabeta de Valois să fie a treia soție a lui Filip.
La nunta sa i-a întâlnit pe pictorul Sofonisba Anguissola, și pe Ana de Mendoza, care va trăi cu ea tot restul vieții sale. Filip al II-lea a numit-o pe Anguissola să fie doamnă de onoare și pictor de curte pentru regina sa. Sub îndrumarea lui Anguissola, Elisabeta și-a îmbunătățit abilitățile de pictură ca amatoare. Anguissola a influențat, de asemenea, lucrările artistice ale copiilor ei, Isabella Clara Eugenia și Caterina Michaela, în timpul petrecut la curte.
Filip a fost complet fermecat de mireasa sa în vârstă de 14 ani, iar până în 1564 a renunțat la infidelitățile sale. În ciuda diferenței semnificative de vârstă, Elisabeta era, de asemenea, destul de mulțumită de soțul ei (în scrisorile către mama ei, ea s-a proclamat norocoasă că s-a căsătorit cu un prinț atât de fermecător). Lui Filip îi plăcea să găzduiască turnee cavalerești pentru a-și distra soția. Elisabeta juca rolul de doamnă de onoare pentru cei trei tineri prinți de la Curtea spaniolă: Carlos, Prinț de Asturia, Ioan de Austria (fiul nelegitim al lui Carol al V-lea) și Alexandru Farnese, Duce de Parma (fiul fiicei nelegitime a lui Carol al V-lea, Margareta).
Elisabeta fusese inițial logodită cu fiul lui Filip, Carlos, Prinț de Asturia, dar complicațiile politice au necesitat în mod neașteptat, în schimb, o căsătorie cu Filip. Relația ei cu tulburatul ei fiu vitreg Carlos a fost caldă și prietenoasă. În ciuda rapoartelor privind comportamentul său din ce în ce mai bizar, Carlos a fost întotdeauna bun și blând cu Elisabeta. Când în cele din urmă a fost necesar ca Filip să-l închidă (ceea ce a dus în scurt timp la decesul prințului), Elisabeta a plâns zile întregi.
Filip a fost foarte atașat de Elisabeta, rămânând aproape de ea chiar și atunci când a fost bolnavă de variolă. Prima sarcină a Elisabetei, în 1560, s-a soldat cu un fiu născut mort, urmată în 1564 de un avort spontan de două fete gemene. Ulterior, la 12 august 1566, a născut-o pe infanta Isabella Clara Eugenia a Spaniei, iar la 10 octombrie 1567 pe sora mai mică a Isabelei, Catherine Michelle a Spaniei. Phillip și Elisabeta au fost foarte apropiați de ambele fiice ale lor, cumpărându-le gemuri, păpuși, jucării și multe altele. Se spune că „amândoi s-au bucurat la nașterea Isabelei ca și cum ar fi fost nașterea unui fiu”. Elisabeta a suferit un alt avort spontan la 3 octombrie 1568 și a murit în aceeași zi, împreună cu fiica ei nou-născută.
După moartea Elisabetei, Catherine de’ Medici a oferit-o pe fiica ei mai tânără, Margaret, ca mireasă pentru Filip. Filip a refuzat oferta.
.