1 iunie 2016 (Vol. 36, Nr. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. fondator și redactor principal DeeAnn Visk Consulting
Terapia genică trebuie să spargă bastioanele celulare fără a reconstitui Căderea Ierihonului în miniatură
Imunoterapiile împotriva cancerului, vaccinurile împotriva noilor viruși (sau a virușilor vechi în locuri noi) și încercările de a rezolva defectele patogene unicelulare – toate caută să încorporeze tehnologia de transfecție. Această tehnologie, care cuprinde diverse mijloace de introducere a acizilor nucleici în celule, este foarte promițătoare, dar prezintă, de asemenea, provocări serioase.
Aceste provocări au fost cele mai proeminente în încercările de implementare a terapiei genice, care a avut dificultăți în rezolvarea problemei celulelor, organelor și animalelor întregi greu de transfectat.
Aceste provocări de transfecție au fost preluate de mai multe companii de biotehnologie. De exemplu, MaxCyte, Lonza și Mirus Bio oferă electroporarea ca metodă care lasă în urmă puține reziduuri. Se întâmplă că electroporarea nu este potrivită pentru a fi utilizată cu toate animalele, astfel încât sunt necesare alte metode. O tehnică alternativă este infecția virală. Aceasta este folosită de companii precum GenVec.
O altă provocare, una deosebit de relevantă pentru transfecția virală, este potențialul de stimulare a unui răspuns imunitar. Totuși, acest potențial negativ poate fi un adevărat pozitiv în contextul potrivit, care se întâmplă să fie dezvoltarea de vaccinuri. Exploatarea abordărilor de transfecție virală pentru a potența mecanismele de vaccinare este o specialitate a Thermo Fisher Scientific. Compania oferă, de asemenea, transfecția tradițională pe bază de substanțe chimice care funcționează la nivelul întregului animal.
Împreună, companiile menționate până acum oferă tehnologii care acoperă toate modurile principale de transfecție relevantă din punct de vedere terapeutic: transfecția pe bază de substanțe chimice, metode nonchimice (în principal electroporarea) și transducția virală. Abordările hibride, de asemenea, sunt în curs de dezvoltare, așa cum va deveni clar în secțiunile următoare.
Electroporare
Platforma de electroporare a MaxCyte este conformă cu GMP și poate fi extinsă fără probleme de la cercetare la scară comercială. „Sistemul nostru de electroporare în flux permite ca de la un milion până la câteva sute de miliarde de celule să fie transfectate în mai puțin de 30 de minute într-un sistem închis complet automatizat”, explică Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. „Sistemul nostru este atât ISO 9000, cât și în conformitate cu FDA, astfel încât se poate adapta cu ușurință nevoilor de producție la nivel terapeutic.”
„Colaborăm în mod obișnuit cu companii farmaceutice și biotehnologice pentru a dezvolta terapii imunitare și cu celule stem proiectate ex vivo. Uneori, obiectivul este de a fabrica rapid vaccinuri și medicamente biologice cu randament ridicat, cum ar fi anticorpii. Alteori, le permitem clienților să creeze o producție la scară largă de vectori virali cu titru ridicat, folosind celule în suspensie și aderente. Acest lucru nu numai că ajută la dezvoltarea terapeutică, dar poate accelera, de asemenea, aplicațiile de descoperire a medicamentelor.”
Această capacitate de a procesa celule în număr mare sau mic permite oamenilor de știință de pe bancă să dezvolte un protocol de proces folosind electroporarea în flux pentru un număr mic de celule. Extinderea acestui proces este apoi fără probleme, fără durerile de cap obișnuite legate de menținerea calității, deoarece procesul de transfecție rămâne același.
„Această reducere a riscului este foarte atractivă pentru partenerii noștri. Asigurarea consecvenței de la cercetare, la clinică, la scară comercială și de la o serie la alta, de la donator la donator și de la pacient la pacient este esențială pentru a conduce eficient terapiile prin procesul de dezvoltare”, afirmă Dr. Peshwa.
În timp ce abordările chimice și lipidice funcționează bine în cercetarea cu linii celulare stabilite, există adesea consecințe neașteptate ale transfectării celulelor primare. În plus, aceste mijloace chimice tradiționale de transfectare a celulelor sunt dificil de extins la o producție industrială.
Electroporarea, abordarea nonvirală utilizată de MaxCyte, permite ca biologia celulelor transfectate să rămână într-o stare mai naturală la orice scară. Prin prevenirea consecințelor neintenționate în timpul procesului de transfecție, tehnologia MaxCyte poate evita crearea de blocaje rutiere, rezolvând în același timp nevoia de eficiență ridicată a transfecției.
„Aceste intervenții terapeutice trebuie să fie practic garantate pentru a avea un impact negativ minim neintenționat asupra celulelor care sunt modificate – toată biologia trebuie să fie aceeași în fiecare etapă a procesului”, insistă Dr. Peshwa. „În plus, sistemul nostru de electroporare în flux poate fi utilizat într-o manieră automatizată. Acesta este deja utilizat în mod curent în Japonia pentru tratamente terapeutice comerciale și se află în diferite stadii de adoptare în întreaga lume.”
Un alt aspect de luat în considerare este locul unde are loc transfecția. Celulele recoltate de la un pacient sunt transportate în alt oraș pentru procesare? Ce se întâmplă atunci când un pachet este pierdut, sau întârziat, sau suferă fluctuații de temperatură? Platforma oferită de MaxCyte oferă oportunitatea de a dezvolta noi terapii prin procesarea la fața locului a celulelor pacienților, ocolind problemele majore de logistică și COGS (costul bunurilor vândute) ale altor metode.
Engineeringul celulelor este esențial pentru dezvoltarea de terapii bazate pe celule. Sistemul de electroporare al MaxCyte poate evita modificarea neintenționată a fenotipului celular, răspunzând în același timp nevoilor cheie ale provocărilor legate de ingineria celulară: eficiență, consecvență, portabilitate și scalabilitate, potrivit companiei.
Transducții virale
Vectori virali sunt deosebit de utili pentru tranfecția animalelor întregi sau pentru utilizarea cu țesuturi care pot fi dificil de atins prin abordări chimice sau prin electroporare. GenVec este specializată în utilizarea vectorilor virali, în special a adenovirusului, pentru a livra gene în scopuri terapeutice.
„La prima vedere, problemele asociate cu răspunsul imunitar la vectorii virali par a fi problematice”, explică Doug Brough, Ph.D. „Cu toate acestea, am descoperit că acest lucru poate fi folosit pentru a stimula un răspuns imunitar la materiale străine, astfel încât adenovirusurile ar putea fi folosite pentru a livra vaccinuri.”
Într-adevăr, GenVec a studiat amănunțit adenovirusul și a generat mai multe „arome” diferite de adenovirusuri. Atunci când explorează adenovirusurile la alte specii, cum ar fi speciile de gorile și maimuțe, cercetătorii pot folosi vectori care sunt concepuți pentru a evita imunitatea preexistentă pe care populația umană generală o are față de adenovirusuri.
„Biblioteca mare de vectori oferită de GenVec se numește Adenoverse™”, informează Dr. Brough. „Am șters secțiuni mari din adenovirus pentru a limita toxicitatea înnăscută asociată cu tratamentul cu adenovirus. În plus față de prevenirea unui răspuns imunitar dăunător la vector, acest lucru ne permite să încadrăm până la 12 kb în virus.”
Prin utilizarea unei varietăți de abordări, GenVec a lucrat cu o serie de companii la diferite aplicații, terapii cu acizi nucleici și tehnologii de editare genetică. Adenovirusurile modificate pot furniza abordări cu degetul de zinc, atât in vitro, cât și in vivo.
Un exemplu al unei astfel de colaborări se regăsește în cadrul studiului clinic Novartis pentru regenerarea celulelor senzoriale în urechea internă. „Prin infectarea celulelor din urechea internă cu o genă care codifică o proteină de reglementare cheie, pot fi generate noi celule mecanosenzoriale pentru a le înlocui pe cele pierdute din cauza unei leziuni sau a unor condiții genetice inerente”, explică Dr. Brough.
Alte proiecte comune pot fi găsite cu parteneriate în entități pentru tratarea cancerului și dezvoltarea de vaccinuri. „Când vine momentul să comercializeze o tehnologie, GenVec folosește o linie celulară aprobată anterior de FDA pentru aceste aplicații”, clarifică Dr. Brough.
„Un alt avantaj evident al utilizării adenovirusurilor este că acestea pot transfecta cu ușurință animale întregi. De exemplu, o boală devastatoare la animalele de fermă, numită febră aftoasă, este perpetuată de o varietate de virotipuri. Sistemul nostru ar putea permite înlocuirea rapidă a oricărei tulpini care provoacă o epidemie și ar permite furnizarea rapidă a unui vaccin personalizat”, descrie Dr. Brough.
Nucleofection
Lonza oferă o formă avansată de electroporare numită Nucleofection™, care utilizează soluții de transfecție specifice tipului de celule, cuplate cu un sistem de livrare a impulsurilor mai nuanțat care permite transfecția multor tipuri de celule diferite, în special a celulelor umane primare normale.
„În loc să folosim soluții tampon de electroporare standard, noi folosim soluții de transfecție specifice tipului de celule”, spune Gregory Alberts, Ph.D., expert global în domeniu la Lonza. „Acest lucru ne permite să stabilizăm porii generați în timpul administrării impulsurilor. Noi speculăm că porii formați în membrana celulară în timpul electroporării standard se închid rapid. Tehnologia noastră stabilizează porii formați prin electroporare și permite materialului să se difuzeze în celulă și, mai precis, în nucleul celulei.”
Abordarea Nucleofection utilizează multe substraturi diferite: ADN, ARNm, ARNsi, peptide, proteine și molecule mici. Eficiența de transfecție pentru siARN și ARNm este foarte bună, mai bună de 90%. Peptidele mici transfectează de obicei cu o eficiență de aproximativ 80%, iar eficiența pentru ADN plasmidic este cuprinsă între 50% și 90%, în funcție de tipul de celule. Chiar și substraturile mari, proteinele mai mari, cum ar fi anticorpii sau cromozomii artificiali bacterieni (BAC), pot intra în celulele țintă cu randamente de transfecție rezonabil de eficiente.
„Nucleofecția este surprinzător de flexibilă”, declară Dr. Alberts. „A fost folosită pentru a transfecta toate tipurile de celule umane primare. A fost utilizată în generarea de iPSC (celule stem pluripotente induse), în transfecția CRISPR și a altor substraturi de editare a genomului, precum și în transfecția unor ținte mai exotice, cum ar fi familia de paraziți Plasmodium care provoacă malaria. Alte organisme similare pot fi, de asemenea, transfectate cu Nucleofection pentru a permite cercetarea în domeniul bolilor tropicale.”
Platforma Nucleofection este scalabilă. De exemplu, sistemul Nucleofection de mare randament poate gestiona formate de 96 de godeuri și 384 de godeuri. Adesea, acest sistem va fi utilizat într-o instalație de screening de bază. Oamenii de știință de pe bancă pot utiliza Nucleofector 4D cu debit mai mic pentru a optimiza condițiile de testare. Deoarece Nucleofector 4D Nucleofector de bancă utilizează aceleași condiții de transfecție, lucrează cu același număr de celule și oferă aceleași performanțe ca și dispozitivele cu randament mai mare, atunci când este timpul să se treacă la o scară mai mare, testul nu necesită o re-optimizare.
„Continuitatea sistemului permite compararea merelor cu mere pe măsură ce măriți sau micșorați scara proiectului”, ilustrează Dr. Alberts.
„Suntem în curs de testare beta a unui nou dispozitiv de transfecție de volum mare care va fi capabil să transfecteze între 200 de milioane și 1 miliard de celule într-un format de la 1 la 20 ml. Rezultatele preliminare arată că dispozitivul transfectează celulele umane primare sau liniile celulare la aceleași niveluri ca și celelalte dispozitive Lonza Nucleofector”, continuă Dr. Alberts. „Acest produs va fi lansat doar în scopuri de cercetare, deși, datorită capacității Nucleofection de a transfecta atât de bine celulele umane primare, va exista, fără îndoială, interes pentru utilizarea acestui dispozitiv în aplicații cu orientare mai mult clinică.”
Dr. Alberts preconizează că Nucleofection ar putea juca un rol în terapiile inovatoare și personalizate împotriva cancerului, cum ar fi terapia cu celule T cu antigen chimeric (CAR-T), precum și alte terapii pe bază de celule care necesită transfectarea sau modificarea genomică a celulelor umane primare.
„Capacitatea Nucleofection de a transfeca ușor și eficient celulele T umane primare va atrage atenția în abordările de terapie genică pentru tratarea bolilor. Abordarea Lonza pentru potențialele aplicații de terapie genică
de asemenea, are o amprentă foarte mică. Acest lucru este crucial, deoarece mașinăria „rămasă” de la alte tehnici de transfecție poate duce la consecințe biologice neintenționate”, conchide Dr. Alberts.
Cercetătorii de la Lonza au evaluat capacitatea tehnologiei Nucleofection a companiei de a transfecta celule musculare netede aortice de șobolan adult disociate (AoSMC). AoSMC de șobolan crioprezervate au fost decongelate și cultivate timp de șapte zile în plăci de cultură cu 24 de puțuri, iar celulele au fost transfectate în aderență cu ajutorul soluției AD1 4D-Nucleofector Y. Douăzeci și patru de ore după transfecție, celulele au fost fixate și analizate. Actina este reprezentată în roșu; GFP, în verde.
Formulări
Mirus Bio dezvoltă și produce formulări noi de transfecție, care permit livrarea cu eficiență ridicată și toxicitate redusă a multor tipuri diferite de molecule de acid nucleic. Multe dintre formulări sunt lipsite de componente de origine animală. „Fără animale” este o calitate importantă pentru aplicațiile preclinice și clinice.
Sistemul CRISPR necesită livrarea unui ARN ghid (gRNA) și exprimarea endonucleazei Cas9, care poate fi sub formă de proteină, ARNm sau ADN. Mirus Bio oferă soluții de transfecție pentru a sprijini livrarea eficientă a tuturor diferitelor molecule care codifică Cas9. Atunci când folosesc metode chimice de transfecție pentru livrarea proteinei Cas9, cercetătorii pot folosi niveluri mult mai mici de proteină dacă aceasta este precomplexată cu ARNg.
„Unele tipuri de celule greu de transfectat dau randamente mai mari de clivaj cu transfecția proteinei Cas9 complexată în cadrul complexului RNP (ribonucleoproteină)”, afirmă Laura Juckem, Ph.D., lider de grup R&D la Mirus Bio. „Sistemul dinamic de livrare Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System livrează eficient complexele RNP și permite utilizarea unor concentrații mai mici de proteină Cas9 în comparație cu electroporarea.”
O altă provocare cu care se confruntă companiile este trecerea de la culturile aderente la culturile în suspensie pentru a acomoda cantitatea mare de material necesară pentru studiile clinice. Acest lucru este valabil în special pentru producția de lentivirus recombinant și de virus adeno-asociat (AAV). „Lucrăm îndeaproape cu clienții noștri pentru a ne asigura că transfecțiile lor sunt reușite și că schimbările în fluxul lor de lucru continuă să producă produse de înaltă calitate”, explică Dr. Juckem.
„Pentru terapia celulară, sistemul de expresie CHO-gro® a fost dezvoltat pentru a oferi randamente ridicate de proteine bioterapeutice în celule CHO în suspensie. Acest sistem optimizat promovează o creștere celulară de înaltă densitate și permite cercetătorilor să obțină o cantitate suficientă de proteine pentru a efectua studii preclinice și analize de caracterizare inițială”, conchide Dr. Juckem.
Această imagine, dintr-o prezentare Mirus Bio care descrie transfecția de înaltă eficiență a celulelor stem, indică faptul că celulele somatice, cum ar fi celulele fibroblaste adulte, pot fi transfectate sau transducute prin mai multe metode cu o combinație de factori de transcripție. Odată ce celulele au fost reprogramate la o stare pluripotentă, ele pot fi ghidate către diferite sorți prin adăugarea de factori de creștere și/sau transfecția de markeri de selecție conduși de promotori specifici pentru fiecare tip de celulă. Imaginea subliniază faptul că reactivii de transfecție pot fi adăugați la un flux de lucru cu celule stem în mai multe puncte.
Abordări cu animale întregi
Thermo Fisher Scientific rămâne la curent cu nevoile clienților de a genera date mai relevante din punct de vedere biologic folosind celule primare, mai degrabă decât linii celulare imortalizate. Celulele primare sunt în mod tradițional mai dificil de transfectat prin metode chimice. Cu toate acestea, datele generate de culturile celulare primare tind să ofere răspunsuri care se traduc mai bine în modelele in vivo de animale întregi.
Modelurile de culturi celulare tridimensionale, care produc rezultate mai pertinente decât culturile celulare bidimensionale, sunt mai dificil de transfectat cu metodele tradiționale.
„Transfectarea culturilor primare cu ADN este o provocare. Utilizarea ARNi (acid ribonucleic inhibitor mic), ARNm (ARN mesager) și a proteinelor în mod direct este mai ușor de acceptat de către celulele primare, deoarece acești compuși trebuie doar să fie livrați în citoplasmă și nu în nucleul celular”, afirmă Xavier de Mollerat du Jeu, doctor, director de R&D la Thermo Fisher Scientific.
„Livrarea către nucleu are loc pe măsură ce celulele se divid”, continuă Dr. de Mollerat „Deoarece celulele primare nu se divid la fel de ușor ca liniile celulare, putem ocoli problema prin livrarea moleculelor în citoplasmă și nu în nucleu.”
Continuând căutarea unor sisteme mai relevante din punct de vedere biologic la animale întregi, „am descoperit că utilizarea in vivo a Invivofectamine® 3.0 poate reduce în mod eficient expresia unei proteine cu 90% în celulele hepatice”, articulează Dr. de Mollerat. „Această utilizare in vivo a Invivofectamine oferă oamenilor de știință un model mai eficient al modului în care arată tratamentele la nivelul întregului animal.”
O altă aplicație a tehnologiei de transfecție este dezvoltarea de vaccinuri. Calendarul pentru dezvoltarea vaccinurilor poate fi scurtat foarte mult prin utilizarea ARNm transfectat pentru a exprima antigene împotriva cărora organismul poate dezvolta un răspuns imunitar. Având în vedere numărul de virusuri noi întâlnite în lume, cum ar fi Zika și chikungunya, faptul de a avea capacitatea de a dezvolta rapid vaccinuri va îmbunătăți foarte mult sănătatea mondială.
Cu dezvoltarea continuă a terapiilor imune care vizează cancerele, celulele T sunt adesea vizate cu receptori specifici. „Am lucrat cu companii interesate să dezvolte aceste terapii”, elucidează Dr. de Mollerat. „Lucrăm îndeaproape cu companiile pentru a răspunde la întrebările legate de modul de fabricare a acestor tratamente, de a face aceste tratamente la scară largă și de a le face disponibile la nivel mondial.”
Invivofectamina 3.0 este un reactiv furnizat de Thermo Fisher Scientific pentru livrarea in vivo a RNAi. Potrivit companiei, o singură injecție are ca rezultat un knockdown semnificativ în ziua 1 și timp de până la 3 săptămâni. Această constatare a reieșit dintr-un studiu în care reactivul a fost injectat în coada unui rozător la diferite doze (1, 0,5 și 0,25 mg/kg). Serul a fost colectat în zilele 2, 5, 9, 16, 23 și 30, iar serul a fost analizat în vederea eliminării proteinei FVII printr-un test cromogenic. Compania a observat că o cantitate mai mare de siRNA în complexele injectate a dus la o doborâre de durată mai lungă în intervalul testat.