Structura țesutului moale fosil
Placi mici de țesut (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d și figurile suplimentare 2-6) sunt strâns asociate cu penele fosile (i.e., de obicei la mai puțin de 500 µm de reziduuri de pene carbonate, Fig. suplimentară 2e, g, j, k, o, s, t). Petele sunt în mod cert de țesut fosil și nu reflectă contaminarea suprafeței cu material modern în timpul pregătirii probei, deoarece sunt conservate în fosfat de calciu (a se vedea „Tafonomie”, mai jos); în plus, mai multe probe prezintă margini care sunt suprapuse, parțial, de matricea înconjurătoare. Prin urmare, țesuturile nu au aderat pur și simplu la suprafața probei ca urmare a contaminării cu particule purtate de aer în laborator.
Tesuturi moi fosfatizate la dinozauri maniraptorieni non-aviani și la o pasăre bazală. a-h Imagini electronice retrodifuzate ale țesuturilor din Confuciusornis (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosaurus (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosaurus (IVPP V 12811; c, h) și Microraptor (IVPP V 17972A; d). a-d Pete mici de țesut de formă neregulată. e Detaliu al suprafeței țesutului care arată textura poligonală. f Secțiune verticală cu fascicul de ioni focalizat prin țesutul moale care arată stratul fibros intern care separă două straturi fără structură. g, h Secțiune oblică fracturată prin țesuturile moi, care arată straturile vizibile în f
Petele de țesut au în mod obișnuit o grosime de 3-6 µm și sunt plane (Fig. 1a-e). Secțiunile transversale și suprafețele fracturate arată un strat fibros intern (1,0-1,2 µm grosime) între două straturi mai subțiri fără structură (0,2-0,5 µm grosime) (Fig. 1f-h). Suprafața externă a stratului lipsit de structură este netedă și poate prezenta o textură poligonală subtilă definită de poligoane cu o lățime de 10-15 µm (Fig. 1e, h).
Stratul fibros prezintă, de asemenea, poligoane (Fig. 1f, h și 2a-e, și Fig. suplimentară 6) care conțin rețele de fibre dens împachetate cu o lățime de 0,1-0,5 µm (Fig. 2f-i și Fig. suplimentară 5f). Fibrele bine conservate prezintă o răsucire helicoidală (Fig. 2h, i). Fibrele din părțile marginale ale fiecărui poligon au o lățime de 0,1-0,3 µm și sunt orientate paralel cu suprafața țesutului; cele din interiorul fiecărui poligon au o lățime de 0,3-0,5 µm și sunt de obicei perpendiculare pe suprafața țesutului (Fig. 2b, h și Fig. Suplimentară S6d). În zona marginală de 1-2 µm a fiecărui poligon, fibrele sunt, de obicei, ortogonale față de marginea laterală a poligonului și se termină la poligoanele adiacente sau formează o punte de legătură între acestea (Fig. 2f, g și Fig. suplimentară 6e). Poligoanele sunt, de obicei, echidimensionale, dar sunt local alungite și aliniate reciproc, fibrele groase din fiecare poligon fiind subparalele cu suprafața țesutului, iar fibrele subțiri, paralele cu marginea poligonului (Fig. 2j, k și Fig. Suplimentară 6g-l). Unele poligoane prezintă o depresiune centrală (Fig. 2c-e și Fig. Suplimentară 6a-c) în care fibrele groase pot înveli o structură globulară de 1-2 µm lățime (Fig. 2e).
Ultrastructura țesuturilor moi la Confuciusornis (IVPP V 13171). a, b Micrografii electronice de retrodifuzie; toate celelalte imagini sunt micrografii electronice secundare. a, b Poligoane strâns compactate. c Detaliu de poligoane care arată conținutul fibros, cu d desen interpretativ. e-g Poligon (e), cu detalii ale regiunilor indicate, care arată tonofibrele care formează punți (f) și se lipesc (g) la joncțiunea dintre poligoane. h, i Înfășurarea elicoidală a tonofibrelor. h Vedere oblică a poligonului cu tonofibrele centrale orientate perpendicular pe suprafața poligonului. j, k Poligoane care prezintă deformări de tip întindere
Corneocite fosile
Textura acestor țesuturi fosile diferă de cea a cochiliilor de conchostracee și a solzilor de pește din sedimentul gazdă, a cochiliei de Mytilus modern, a rahisului de pene moderne și fosile și a epidermei reptilelor moderne (Fig. Suplimentară 7a-n). Geometria alungită a unor poligoane (Fig. 2j, k și Fig. Suplimentară 6g, l) implică deformarea elastică a unui țesut nebiomineralizat din cauza stresului mecanic. Pe baza dimensiunii, geometriei și structurii interne, structurile poligonale sunt interpretate ca fiind corneocite (keratinocite epidermice). La amniotele moderne, acestea sunt celule poliedrice-aplatizate (1-3 µm × cca. 15 µm) umplute cu tonofibrile de cheratină, lipide și proteine de matrice18,19,20 (Fig. 3a, b și figurile suplimentare 2u-x, 8, 9). Stratul exterior lipsit de structură al materialului fosil corespunde marginii celulare; acesta este mai gros decât șablonul biologic original, adică învelișul celular cornos și/sau membrana celulară, dar acest lucru nu este neașteptat, reflectând o supracreștere diagenetică prin fosfat de calciu (a se vedea „Tafonomie”). Fibrele din corneocitele fosile sunt identificate ca tonofibrile mineralizate: mănunchiuri drepte, neramificate, de fibrile de α-keratină supraînfășurate, cu o lățime de 0,25-1 µm18,21 care reprezintă componenta principală a citoscheletului corneocitar22 și sunt învelite de proteine citoscheletale amorfe22. În fosile, tonofibrilele subțiri sunt adesea lipite de cele ale celulei adiacente (Fig. 2g și Fig. Suplimentară 6e), dar, local, pot acoperi granița dintre celulele adiacente (Fig. 2f). Aceasta din urmă amintește de desmosomi, regiuni de atașament intercelular puternic între corneocitele moderne23. Structurile globulare centrale din interiorul corneocitelor fosile seamănă cu nucleele celulelor moarte24, ca și în corneocitele păsărilor actuale (dar nu și ale reptilelor și mamiferelor actuale)24 (Fig. suplimentară 8). Poziția acestor nuclei picnotici este adesea indicată prin depresiuni pe suprafața corneocitului la păsările existente24 (Fig. 3b); unele celule fosile prezintă depresiuni similare (Fig. 2c și Fig. suplimentară 6a-c).
Corneocite la păsările exante. a-d Micrografii electronice de scanare a pielii vărsate la înotătorul zebră exant (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d). a Corneocite care definesc textura poligonală. b Depresiunea centrală (săgeată) marchează poziția nucleului picnotic. c, d Fulgii de piele căzută antrenați în interiorul penelor
Tafonomie
Ceratina este o biomoleculă relativ recalcitrantă datorită structurii sale paracristaline puternic reticulate și caracterului său hidrofob nepolar23. Replicarea corneocitelor fosile în fosfat de calciu este, prin urmare, oarecum neașteptată, deoarece acest proces necesită, de obicei, gradienți geochimici abrupți caracteristici descompunerii timpurii25 și se aplică, de obicei, țesuturilor predispuse la descompunere, cum ar fi mușchii26 și țesuturile digestive27. Cu toate acestea, țesuturile recalcitrante, cum ar fi colagenul dermic, pot fi reproduse în fosfat de calciu în cazul în care conțin o sursă inerentă de calciu și, în special, ioni de fosfat care sunt eliberați în timpul descompunerii28. Corneocitele conțin surse ale acestor doi ioni. În timpul diferențierii terminale, concentrațiile intracelulare de calciu cresc29 și lanțurile de α-keratină sunt fosforilate în mod extensiv23. Mai mult, granulele lipidice ale corneocitelor30 sunt bogate în fosfor și fosfat31. Aceste fracțiuni chimice ar fi eliberate în timpul degradării granulelor și ar precipita pe substratul organic rămas, adică pe tonofibrile.
La mamiferele existente, rețelele dens compacte de tonofibrile necesită proteine matriciale interkeratine abundente pentru stabilitate32. Cu toate acestea, aceste proteine nu sunt evidente în fosile. Acest lucru nu este neașteptat, deoarece proteinele sunt rare în corneocitele aviare existente33 și, în mod critic, apar sub formă de monomeri dispersați34 și ar avea un potențial de conservare mai scăzut decât fasciculele de keratină puternic reticulate și polimerizate ale tonofibrilelor. Stratul exterior lipsit de structură al corneocitelor fosile este mai gros decât șablonul (șabloanele) biologic(e) probabil, și anume, învelișul celular cornos (un strat de lipide, cheratină și alte proteine cu o grosime de până la 100 nm care înlocuiește membrana celulară în timpul diferențierii terminale34) și/sau membrana celulară. Acest lucru poate reflecta un micro-mediu local favorabil precipitării fosfatului de calciu: în timpul diferențierii terminale, la periferia corneocitelor în curs de dezvoltare se acumulează granule de keratohialină, o proteină extensiv fosforilată35 cu o mare afinitate pentru ionii de calciu36 . Grosimea stratului exterior solid de fosfat de calciu din fosile, plus tranziția treptată de la acesta la stratul fibros interior, sugerează că precipitarea fosfatului a avut loc de la margini spre interiorul corneocitelor. În acest scenariu, disponibilitatea fosfatului în zonele marginale ale celulelor ar fi depășit-o pe cea necesară pentru replicarea tonofibrilelor. Fosfatul suplimentar ar fi precipitat sub formă de fosfat de calciu în spațiile interstițiale dintre tonofibrile, progresând spre interior de la fața interioară a marginii celulei.
Dezlipirea pielii la dinozaurii cu pene și la păsările timpurii
La amniotele existente, stratul cornificat epidermic are de obicei o grosime de 5-20 de celule (dar grosimea variază în funcție de specie și de localizarea pe corp38). Cu toate acestea, peticele de cornete fosile au grosimea unei singure celule (Fig. 1f și fig. suplimentare 5c, 10). Acest lucru, plus dimensiunea constant mică (<400 μm) a petelor și fidelitatea remarcabil de mare a conservării, nu este în concordanță cu conservarea selectivă a unei foi continue de țesut in situ. Într-o minoritate (n = 8) de exemple, pielea apare la marginea eșantionului de țesuturi moi fosile și, astfel, ar putea reprezenta potențial un fragment mai mic dintr-o bucată inițial mai mare de piele fosilă (cu restul bucății pe placa fosilă). Cu toate acestea, în majoritatea exemplelor, întregul contur al fragmentului de piele este conținut în marginea eșantionului. Examinarea marginilor diferitelor eșantioane la o mărire mare relevă faptul că eșantionul și sedimentul înconjurător se află adesea exact în același plan (de exemplu, figura suplimentară 10). Chiar și în cazul în care marginea eșantionului de piele este acoperită de sedimente, este puțin probabil ca eșantionul să fi fost mult mai mare decât dimensiunea aparentă, deoarece pielea fosilă, fiind aproape perfect plană, formează un plan natural de divizare.
Nu există nicio dovadă că grosimea păstrată a pielii este un artefact al pregătirii sau al eroziunii. În timpul despicăturii unei plăci de rocă, planul de despicare trece frecvent prin țesuturile moi într-un mod neuniform, expunând structuri la diferite adâncimi. La fosilele studiate aici, planul de despicare trece de obicei prin corneocite (expunând structura internă a acestora) și rareori de-a lungul feței exterioare a stratului de corneocite. Nu există dovezi privind îndepărtarea a mai mult de un strat de corneocite: Secțiunile FIB arată conservarea unui singur strat, iar mai multe imagini SEM prezintă secțiuni verticale complete prin pielea conservată (în care este vizibilă relația cu sedimentul supra și subiacent), cu dovezi ale existenței unui singur strat de corneocite. Umplutura internă fibroasă a corneocitelor fosile este expusă acolo unde planul de divizare a plăcii fosile trece prin peticele de țesut. Cu toate acestea, topografia corneocitelor fosile variază în funcție de poziția planului de despicare, care poate varia local prin țesuturile moi la scară milimetrică: corneocitele se pot prezenta cu margini ridicate și o depresiune centrală sau cu margini deprimate și o zonă centrală înălțată (Fig. S9).
Dimensiunile, geometria neregulată și grosimea petelor de corneocite seamănă cu fulgii desprinși din stratul cornificat (particule asemănătoare cu mătreața39; Fig. 3). La păsările exante, corneocitele sunt vărsate individual sau în petice de până la 0,5 mm2 care pot fi antrenate în interiorul penelor (Fig. 3c, d și Fig. suplimentară 2u, v). Fosilele descrise aici oferă prima dovadă a procesului de descuamare a pielii la păsările bazale și la dinozaurii maniraptorieni neavioși și confirmă faptul că cel puțin unii dinozauri neavioși își descuamează pielea în petice mici40. Acest stil de schimbare a pielii este identic cu cel al păsărilor moderne18 (Fig. 3c, d) și al mamiferelor20 și implică o creștere somatică continuă. Acest lucru contrastează cu multe reptile actuale, de ex, lepidosauri, care își elimină pielea întreagă sau în secțiuni mari21, dar stilul de eliminare a pielii poate fi influențat de factori cum ar fi dieta și mediul41.
Implicații evolutive ale structurii corneocitelor fosile
Corneocitele fosile prezintă adaptări cheie întâlnite la omologii lor de la păsările și mamiferele actuale, în special geometria lor poligonală aplatizată și conținutul celular fibros, în concordanță cu tonofibrilele de α-keratină16. Mai mult, tonofibrilele fosile (ca și în exemplele existente22) prezintă conexiuni intercelulare robuste și formează o schelă continuă de-a lungul foii de corneocit (Fig. 2b, c, j și Fig. Suplimentară 6). În schimb, corneocitele de la reptilele exante conțin o masă omogenă de β-keratină (cu proteine suplimentare prezente în învelișul celular) și fuzionează în timpul dezvoltării, formând straturi β mature fără granițe celulare distincte42. Păstrarea nucleelor picnotice în corneocitele fosile este o trăsătură distinct aviară care nu se observă la reptilele moderne (dar vezi ref. 20).
Se consideră că morfogeneza și diferențierea epidermică au deviat la therapside și sauropside31. Datele noastre susțin alte dovezi că trăsăturile epidermice comune la păsări și mamifere indică o evoluție convergentă43 și sugerează că un conținut corneocitar bogat în lipide poate fi un caracter derivat din punct de vedere evolutiv la păsări și la maniraptorienele non-aviane cu pene. Studiile Evo-devo au sugerat că epiderma aviară ar fi putut apărea în urma extinderii regiunilor de balama în pielea solzoasă purtătoare de „protopene „20. Deși lipsesc dovezile fosile pentru această tranziție, datele noastre arată că epiderma păsărilor bazale și a dinozaurilor maniraptorieni neavioși a evoluat deja cu un caracter hotărât modern, chiar și în cazul taxonilor care nu sunt capabili de zbor cu motor. Acest lucru nu exclude posibilitatea ca cel puțin unele dintre trăsăturile epidermice descrise aici să provină de la theropode mai bazale, în special acolo unde pielea conservată nu prezintă urme de solzi (ca la Sciurumimus44). Mecanismele genomice rafinate pentru modularea expresiei complexe a keratinei în epidermă45, diferențierea terminală a keratinocitelor și împărțirea sintezei de α- și β-keratină în pielea animalelor cu pene32 au fost probabil modificate în tandem cu evoluția penelor aproape de baza Maniraptora până la sfârșitul Jurasicului mediu (Fig. 4). Datele fosile existente sugerează că acest lucru a avut loc după evoluția ciocului la Maniraptoriformes și înainte de evoluția patagiei și a pterilelor membrelor anterioare (Fig. 4); primele apariții fosile ale tuturor acestor caracteristici se întind pe o perioadă de aproximativ 10-15 Ma, sugerând o explozie de inovație în evoluția tegumentului cu pene în apropierea și dincolo de granița dintre Jurasicul inferior și Jurasicul mediu. Cea mai veche dovadă de musculatură dermică asociată cu penele este cu aproximativ 30 Ma mai tânără, la o pasăre ornitotorace de 125 Ma17. Având în vedere rolul esențial jucat de această rețea dermică în susținerea penelor și în controlul orientării penelor18, absența sa la maniraptorienii non-aviari cu pene poate reflecta o prejudecată tafonomică.
Filogenie schematică, adaptată la timpul geologic, a unor coelurozauri selectați, care arată modelul de achiziție a modificărilor cheie ale pielii. Filogenia este cel mai probabil dintre modelele de maximă verosimilitate, pe baza lungimilor minime ale ramurilor (mbl) și a tranzițiilor care au loc ca all-rates-different (ARD). Ghearele și tălpile sunt considerate primitive la coelurozauri. Datele disponibile indică faptul că keratinocitele modificate, precum și depunerile continue, au luat naștere aproape de baza Maniraptora; se preconizează că acest lucru se va deplasa, pe baza viitoarelor descoperiri de fosile, spre baza Coelurosauria, pentru a include alți taxoni cu pene
În anumite aspecte, corneocitele fosile sunt în mod distinct non-aviane și indică faptul că dinozaurii cu pene și păsările timpurii aveau o anatomie tegumentară unică și o fiziologie de tranziție între cea a păsărilor moderne și cea a dinozaurilor fără pene. La păsările actuale, tonofibrilele corneocitelor sunt dispersate liber printre lipidele intracelulare19; acest lucru facilitează răcirea prin evaporare ca răspuns la producerea de căldură în timpul zborului și izolarea prin plumaj46. În schimb, tonofibrilele fosile sunt dens împachetate și umplu interiorul celulei. Nu există dovezi de contracție post-mortem a corneocitelor fosile: gama de dimensiuni este în concordanță cu cele de la păsările moderne și nu există dovezi de încrețire diagenetică, contorsionare sau separare a celulelor individuale. Acest lucru sugerează cu tărie că densitatea păstrată a tonofilamentelor din corneocitele fosile reflectă densități inițial mai mari decât la păsările actuale. Aceasta nu este o funcție a mărimii corpului: păsările existente de dimensiuni disparate (de exemplu, înotătorul zebră și struțul) prezintă tonofibrile slab dispersate47. Astfel, este probabil ca păsările fosile să fi avut o nevoie fiziologică mai mică de răcire prin evaporare și, la rândul lor, o producție mai mică de căldură corporală legată de activitatea de zbor46 decât la păsările moderne. Acest lucru este în concordanță cu alte dovezi privind ratele metabolice bazale scăzute la dinozaurii maniraptorieni neavioși47,48 și la păsările bazale47 și cu ipotezele conform cărora penele lui Microraptor49 și, potențial, ale lui Confuciusornis48 (dar a se vedea ref. 50) nu erau adaptate pentru zborul cu motor, cel puțin pentru perioade îndelungate50.
.