Proteine

Lizozimul a fost prima enzimă a cărei structură cu raze X a fost determinată la rezoluție înaltă. Acest lucru a fost realizat în 1965 de către David Phillips, care lucra la Royal Institution din Londra. Phillips a continuat să propună un mecanism de acțiune a lizozimei care s-a bazat în principal pe datele structurale. De atunci, mecanismul lui Phillips a fost confirmat de dovezile experimentale, după cum vom vedea mai târziu.

Lizozima se găsește pe scară largă în celulele și secrețiile (inclusiv lacrimile și saliva) vertebratelor, iar albușul de ou de găină este deosebit de bogat în această enzimă. Lizozima catalizează hidroliza legăturilor glicozidice care leagă acidul N-acetilmuramic (NAM) și N-acetilglucozamina (NAG) în polizaharidele din pereții celulelor bacteriene. În acest fel, deteriorează integritatea peretelui celular și acționează astfel ca agent bacteriocid. Legătura NAM-NAG este reprezentată în figura 40, cu indicarea locului de scindare de către lizozim.

Figura 40 O parte din componenta polizaharidică a pereților celulari bacterieni, care arată alternanța de resturi de acid N-acetilmuramic (NAM) și N-acetilglucozamină (NAG). Această polizaharidă este un substrat pentru lizozimă, care hidrolizează legătura glicozidică din poziția indicată. (Pentru claritate și pentru a permite o reprezentare liniară a moleculei, unele dintre legături sunt reprezentate sub formă de zig-zag.)

Lizozima este o enzimă relativ mică. Lizozima din albușul de ou de găină este alcătuită dintr-o singură polipeptidă cu o lungime de 129 aminoacizi (figura 41) și cu Mr 14 600. Din datele de difracție a razelor X, se poate observa că există o despicătură distinctă în structura lizozimei (figura 42). Situl activ este localizat în această despicătură. În secvența de aminoacizi din figura 41 și în modelul de umplere a spațiului al lizozimei din figura 42, au fost evidențiate acele reziduuri care delimitează buzunarul de legare a substratului în proteina pliată.

Figura 41 Secvența de aminoacizi a lizozimei din albușul de găină, cu reziduurile care delimitează buzunarul de legare a substratului evidențiate cu gri. Asp 52 și Glu 35, reziduuri cheie în situsul activ, sunt evidențiate cu roșu și, respectiv, galben.

Figura 42 Un model de umplere a spațiului al lizozimei din albușul de ou de găină, în care au fost evidențiate reziduurile cheie. Asp 52 este în roșu; Glu 35 este în galben; unele dintre reziduurile care căptușesc buzunarul de legare a substratului sunt reprezentate în gri.

Sitemul activ al lizozimei este un șanț lung care poate găzdui șase zaharuri ale lanțului polizaharidic la un moment dat. La legarea polizaharidului, enzima hidrolizează una dintre legăturile glicozidice. În cazul în care cele șase zaharuri din porțiunea de polizaharid sunt identificate ca fiind A-F, locul de clivaj se află între D și E, așa cum se indică în figura 40. Cele două fragmente de polizaharide sunt apoi eliberate. Figura 43 descrie etapele acestei reacții, care sunt, de asemenea, descrise în detaliu mai jos.

Figura 43 Mecanismul catalitic al lizozimei. Rețineți că sunt reprezentate doar reziduurile cheie implicate în cataliză (Glu 35 și Asp 52). Etapele sunt descrise în detaliu în text. (Bazat pe Phillips, 1966)

1. La legarea la enzimă, substratul adoptă o conformație încordată. Reziduul D este distorsionat (nu este prezentat în diagramă) pentru a găzdui o grupare -CH2OH care altfel ar intra în contact nefavorabil cu enzima. În acest fel, enzima forțează substratul să adopte o conformație apropiată de cea a stării de tranziție.

2. Reziduul 35 al enzimei este acid glutamic (Glu 35) cu un proton pe care îl transferă cu ușurință la atomul O polar al legăturii glicozidice. În acest fel, legătura C-O din substrat este scindată (figura 43a și b).

3. Reziduul D al polizaharidului are acum o sarcină pozitivă netă; acest intermediar de reacție este cunoscut sub numele de ion oxoniu (figura 43b). Enzima stabilizează acest intermediar în două moduri. În primul rând, un reziduu de aspartat din apropiere (Asp 52), care se află sub formă de carboxilat cu sarcină negativă, interacționează cu sarcina pozitivă a ionului de oxoniu. În al doilea rând, distorsiunea reziduului D permite ca sarcina pozitivă să fie împărțită între atomii C și O ai acestuia. (Rețineți că această partajare a sarcinii între atomi este denumită rezonanță în același mod ca și partajarea electronilor între atomii grupului peptidic). Astfel, ionul de oxoniu intermediar este starea de tranziție. În mod normal, un astfel de intermediar ar fi foarte instabil și reactiv. Asp 52 ajută la stabilizarea ionului oxonium, dar nu reacționează cu acesta. Acest lucru se datorează faptului că, la o distanță de 3 Å, grupările reactive sunt prea îndepărtate.

4. Acum, enzima eliberează reziduul E cu polizaharidul atașat, obținând un intermediar glicozil-enzimatic. Ionul oxoniu reacționează cu o moleculă de apă din mediul solvent, extrăgând o grupare hidroxil și reprotonând Glu 35 (figura 43c și d).

5. Enzima eliberează apoi reziduul D cu polizaharidul atașat și reacția este completă.

Mecanismul Phillips pentru cataliza lizozimei, așa cum a fost prezentat mai sus, este susținut de o serie de observații experimentale. În special, importanța lui Glu 35 și Asp 52 în acest proces a fost confirmată prin experimente de mutageneză dirijată pe site (SDM). SDM este o tehnică foarte puternică pentru examinarea rolului reziduurilor individuale de aminoacizi în funcția unei proteine și va fi discutată în detaliu în secțiunea 7.2. SDM implică utilizarea tehnologiei ADN recombinant pentru a înlocui selectiv reziduul de interes cu un aminoacid diferit cu proprietăți critice diferite. Proteina rezultată poate fi apoi testată din punct de vedere funcțional, de exemplu, în ceea ce privește legarea substratului sau activitatea catalitică. Atunci când această tehnică a fost aplicată la lizozimă pentru a înlocui Glu 35 cu un reziduu de glutamină (Gln), proteina rezultată a putut în continuare să lege substratul (deși mai puțin puternic), dar nu a avut activitate catalitică. Prin urmare, Glu 35 este esențial pentru activitatea catalitică a lizozimei. Când Asp 52 a fost înlocuit cu un reziduu de asparagină (Asn), proteina mutantă a avut mai puțin de 5% din activitatea catalitică a lizozimei normale (de tip sălbatic), în ciuda faptului că forma mutantă avea de fapt o afinitate de două ori mai mare pentru substrat. Rezultă că Asp 52 este esențial pentru activitatea catalitică a lizozimei. Experimentele folosind agenți chimici care au modificat covalent aceste reziduuri, fără a afecta semnificativ structura cu raze X, au dovedit în mod similar că acestea sunt esențiale pentru activitatea catalitică.

.