Relația dintre dimensiunea rezervorului virusului imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1) în celulele T CD4+ din sângele periferic și raportul celulelor T CD4+:CD8+ la persoanele infectate cu HIV-1 care primesc terapie antiretrovirală foarte activă pe termen lung | The Journal of Infectious Diseases Relația dintre dimensiunea rezervorului virusului imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1) în celulele T CD4+ din sângele periferic și raportul celulelor T CD4+:CD8+:CD8+ T Cell Ratios in Aviremic HIV-1-Infected Individuals Receiving Long-Term Highly Active Antiretroviral Therapy

Abstract

S-a demonstrat că replicarea virusului imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1) persistă la majoritatea persoanelor infectate care primesc terapie antiretrovirală foarte activă (HAART). Cu toate acestea, au lipsit studiile care să abordeze relația dintre nivelurile scăzute de replicare virală în curs de desfășurare și parametrii imunologici, cum ar fi raportul celulelor T CD4+:CD8+, la astfel de persoane. În cazul de față, se arată o corelație inversă semnificativă din punct de vedere statistic între frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și raportul celulelor T CD4+:CD8+ la persoanele infectate care primesc HAART și la care viremia plasmatică a fost suprimată sub limita de detecție pentru perioade prelungite de timp. Nu s-a constatat nicio corelație între frecvența limfocitelor T citotoxice CD8+ (CTL) specifice HIV-1 și raportul celulelor T CD4+ :CD8+ la aceste persoane. Aceste date sugerează că o replicare virală persistentă, de nivel scăzut, în curs de desfășurare, deși nu este suficientă pentru a menține răspunsurile CTL specifice HIV-1, poate explica, în parte, de ce nu se obține o normalizare a raportului de celule T CD4+ :CD8+ la unele persoane infectate tratate cu succes cu HAART.

Utilizarea terapiei antiretrovirale extrem de active (HAART) în tratamentul persoanelor infectate cu virusul imunodeficienței umane de tip 1 (HIV- 1) a schimbat dramatic rezultatul clinic pentru multe persoane infectate și a dus la o scădere substanțială a incidenței SIDA și a mortalității . Cu toate acestea, la majoritatea persoanelor infectate la care viremia plasmatică a scăzut sub limita de detectare, s-a demonstrat prezența virusului capabil de replicare, a ADN proviral HIV-1 (inclusiv 2 cercuri de repetiție terminală lungă), a ARN-ului HIV-1 splicat și ne-splicat în celulele T CD4+ și a rezervoarelor virale neidentificate, iar aceste surse de replicare continuă au apărut ca fiind principalul obstacol în calea eradicării HIV-1.

După inițierea HAART, viremia plasmatică scade rapid până sub limita de detecție la o mare parte dintre persoanele infectate și este urmată de o creștere treptată a numărului de celule T CD4+ și o scădere a numărului de celule T CD8+. Cu toate acestea, normalizarea raporturilor de celule T CD4+:CD8+ nu se realizează la unele persoane infectate care, de altfel, au răspuns cu succes la HAART . În acest sens, s-a sugerat că nivelurile crescute în mod cronic de celule T CD8+ sau raporturile anormale de celule T CD4+:CD8+ din sângele periferic sunt determinate de replicarea virală activă la persoanele infectate care nu sunt tratate sau care primesc o terapie antivirală suboptimală . În plus, s-a demonstrat că expresia markerului de activare CD38 pe celulele T CD8+ este un marker de prognostic al evoluției bolii . Deși s-a sugerat că eșecul de a normaliza raportul dintre celulele T CD4+:CD8+ la unii pacienți care primesc HAART este atribuit suprimării incomplete a replicării virale , nu există date raportate care să abordeze direct această întrebare, în special la pacienții care au primit HAART pentru perioade prelungite de timp și la care viremia plasmatică a fost bine suprimată.

S-a stabilit că rezervorul de celule T CD4+ infectate din sângele periferic, determinat de numărul de celule purtătoare de ADN proviral HIV-1, este menținut de replicarea virală continuă, chiar și la niveluri foarte scăzute . În studiul de față, am evaluat relația dintre raportul dintre numărul de celule T CD4+:CD8+ și frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 în celulele T CD4+ purificate, precum și frecvența limfocitelor T CD8+ citotoxice (CTL) specifice HIV la persoanele infectate care au primit HAART pentru perioade îndelungate de timp și la care viremia plasmatică a fost suprimată până sub nivelul de detectare, așa cum a fost determinată prin teste standard.

Pacienți și metode

Isolarea celulelor T CD4+. Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost obținute prin centrifugare în gradient de densitate ficol-hypaque. Celulele T CD4+ au fost izolate din PBMC ale indivizilor infectați cu HIV-1, folosind o tehnică de separare celulară pe bază de coloană (Stem-Cell Technologies), așa cum este descrisă în altă parte.

PCR cantitativă în timp real a ADN-ului HIV-1. Pentru a determina frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de provirus HIV-1 la persoanele infectate, s-a efectuat o PCR în timp real, așa cum este descris mai jos. ADN genomic a fost izolat din 1-2 × 106 celule T CD4+ purificate, utilizând kitul de izolare a ADN-ului Puregene (Gentra), în conformitate cu specificațiile producătorului. ADN-ul (1 µg) a fost apoi utilizat ca șablon pentru PCR în timp real într-un iCycler (Bio-Rad). Reacția de amplificare a fost realizată în triplu exemplar, folosind 0,5 µM de primeri, 0,2 µM de sondă fluorescentă, 0,8 µM de dNTP, 5 µM de MgCl2 și 2,5 U de Platinum Taq Polimerază (Life Technologies) într-un volum total de 50 ml. S-au utilizat amorsele 5′- GGTCTCTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (amorsă 5′) și 5′-CTGCTAGTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (amorsă 3′) împreună cu sonda fluorescentă 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGTGCCCGTCTCTGTTTTTAMRA- 3′. Condițiile PCR au constat într-o etapă de denaturare la 95°C timp de 3 minute, urmată de 45 de cicluri de 15 s la 95°C și 1 minut la 58°C. ADN-ul ACH-2 diluat în serie a fost, de asemenea, supus PCR-ului de mai sus pentru a obține curbe standard.

Analiză citometrică de flux a celulelor T CD8+ specifice HIV-1. Frecvența celulelor T CD8+ specifice pentru HIV-1 a fost determinată prin analiza celulelor intracelulare interferon (IFN)-γ-pozitive după stimularea cu peptide specifice HIV-1 (20 mer care se suprapun 15 aa). Grupurile de peptide suprapuse (1 µg fiecare; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) care acoperă toate secvențele HIV-1 gag, pol, env și nef au fost inițial incubate cu 3 × 106 PBMC timp de 10 minute într-un tub de 5 ml cu fund rotund (Becton Dickinson) în 0,1 ml de mediu complet într-un incubator cu CO2 la 37 °C. În continuare, în tub s-au adăugat 0,4 ml de mediu complet și, după o incubare de 2 ore, s-a adăugat Brefeldin A (Sigma) în mediu la o concentrație finală de 10 mg/mL pentru a inhiba secreția de IFN-γ. După 6 h de incubație, celulele au fost spălate de două ori, fixate cu soluție de fixare 1× (Becton Dickinson) timp de 10 minute la temperatura camerei și spălate din nou. Celulele au fost permeabilizate cu 1× soluție de permeabilizare 2 (Becton Dickinson) și au fost incubate în continuare la temperatura camerei timp de 10 min. După ce au fost spălate din nou, celulele au fost colorate cu următorii anticorpi: anticorpi anti-CD8 conjugați cu izotiocianat de fluoresceină, anticorpi anti-IFN-γ conjugați cu ficoeritrină, anticorpi anti-CD69 conjugați cu peridină și proteină clorofilă și anticorpi anti-CD3 conjugați cu aloficocianină (Becton Dickinson). Cu o poartă pe limfocitele CD3+CD8+, au fost colectate ~100.000 de evenimente, cu ajutorul unui FACSCalibur (Becton Dickinson), iar frecvența celulelor IFN-γ + CD69+ a fost determinată prin utilizarea software-ului Cellquest (Becton Dickinson).

Analiză statistică. Corelația de rang Spearman a fost utilizată ca măsură a corelației dintre (1) frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și numărul de celule T CD4+ și CD8+ și raportul de celule T CD4+:CD8+ și (2) frecvența CTL-urilor specifice HIV-1 și numărul de celule T CD4+ și CD8+, raportul de celule T CD4+:CD8+ și numărul de celule T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1. Testul exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a determina asocierea raporturilor de celule T CD4+:CD8+ ⩾1,0 sau <1,0 cu încărcăturile provirale în compartimentul de celule T CD4+. Metoda Bonferroni pentru ajustarea valorilor P pentru teste multiple a fost aplicată la corelațiile dintre numărul de celule T CD4+ și CD8+ și raportul celulelor T CD4+:CD8+ cu frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și a fost aplicată la corelațiile dintre numărul de celule T CD4+ și CD8+, raportul celulelor T CD4+:CD8+ și nivelurile de ADN proviral HIV-1 în compartimentul celulelor T CD4+ cu frecvența CTL-urilor HIV-1 specifice.

Rezultate

Corelația dintre mărimea rezervorului de celule T CD4+ al HIV-1 și parametrii imunologici. Pentru a investiga relația dintre dimensiunea rezervorului de celule T CD4+ din sângele periferic pentru HIV-1 și parametrii imunologici periferici anormali la persoanele infectate care primesc cu succes HAART pentru perioade prelungite de timp, am căutat să stabilim corelații între frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și numărul de celule T CD4+ și CD8+ și raportul celulelor T CD4+ :CD8+. A existat o corelație inversă semnificativă din punct de vedere statistic între frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și numărul de celule T CD4+ în sângele periferic al persoanelor infectate pe care le-am studiat (P = 0,02; figura 1A). În schimb, nu s-a constatat nicio corelație între încărcătura de ADN proviral HIV-1 în celulele T CD4+ și numărul de celule T CD8+ (P = 0,34; figura 1B). Atunci când acești 2 parametri imunologici au fost combinați și exprimați sub forma raportului dintre celulele T CD4+:CD8+, s-a observat o corelație inversă puternică între aceste valori și frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 (P 0,01; figura 1C). În plus, 14 (74%) dintre cei 19 pacienți cu un raport de celule T CD4+:CD8+ ,1,0 aveau încărcături provirale de ADN HIV-1 de <1000 de copii/µg de ADN genomic derivat din celulele T CD4+. Dimpotrivă, 10 (77%) din 13 pacienți cu un raport de celule T CD4+:CD8+ >1,0 aveau încărcături provirale de ADN HIV de ,1000 de copii/mg de ADN genomic derivat din celulele T CD4+ (P = 0,01; figura 1C).

Corelația dintre frecvența CTL-urilor specifice HIV-1 și parametrii imunologici și virologici. S-a demonstrat că frecvența CTL-urilor specifice HIV-1 scade treptat după inițierea HAART la persoanele infectate cu HIV-1 din cauza scăderii disponibilității antigenelor HIV-1 . Am investigat relația dintre frecvența CTL-urilor specifice HIV-1 și raportul de celule T CD4+:CD8+ la indivizii infectați care au răspuns cu succes la HAART pentru perioade prelungite de timp. Nu s-a constatat nicio corelație semnificativă din punct de vedere statistic între frecvența CTL-urilor care au răspuns la peptidele specifice HIV derivate din genele gag, pol, env și nef și raportul de celule T CD4+:CD8+ (figura 2). În plus, nu s-a constatat nicio corelație semnificativă din punct de vedere statistic între numărul de CTL-uri specifice HIV-1 și numărul de celule T CD4+ și CD8+ și numărul de celule T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 (datele nu sunt prezentate). De remarcat, a existat o tendință spre un număr mai mare de CTL-uri la persoanele cu un raport mai mic de celule T CD4+:CD8+.

Discuții

Utilizarea pe scară largă a HAART în tratamentul bolii HIV-1 a dus la o îmbunătățire dramatică a rezultatelor clinice . Deși viremia plasmatică poate fi menținută sub limita de detecție la multe persoane infectate care primesc HAART, persistența unor niveluri scăzute de replicare virală în curs de desfășurare în celulele T CD4+ a reprezentat un obstacol major în realizarea eradicării HIV-1 . Într-adevăr, nivelurile scăzute persistente de replicare virală sunt considerate a fi principalul factor implicat în menținerea rezervorului de HIV-1, așa cum reiese din frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 la pacienții a căror viremie plasmatică a fost suprimată de HAART până sub nivelul de detecție al testelor standard . În plus, nivelurile susținute ale numărului ridicat de celule T CD8+ au fost observate la o proporție mare de pacienți infectați care primesc HAART . În acest sens, s-a sugerat că replicarea virală activă este responsabilă pentru nivelurile ridicate de celule T CD8+ și că nivelurile de exprimare a markerului de activare CD38 pe aceste celule s-a dovedit a fi un marker de prognostic al progresiei bolii în absența unei terapii antivirale eficiente .

În ciuda lipsei de date publicate, s-a speculat că ratele inversate ale celulelor T CD4+:CD8+ din sângele periferic al persoanelor infectate care sunt tratate cu succes cu HAART se datorează nivelurilor scăzute de replicare virală în curs de desfășurare . În studiul de față, am examinat dacă raporturile inversate de celule T CD4+:CD8+ la unele persoane infectate care au primit HAART pentru perioade prelungite de timp se datorează suprimării incomplete a replicării HIV-1, așa cum este reflectată de mărimea rezervorului de ADN proviral HIV-1 în celulele T CD4+. Prezența persistentă a ADN HIV proviral HIV- 1 în compartimentul celulelor T CD4+ la pacienții infectați care primesc HAART a fost descrisă în mod convingător în altă parte și s-a considerat că reflectă inhibarea incompletă a replicării virale reziduale în curs, în ciuda suprimării viremiei plasmatice la niveluri nedetectabile . Am demonstrat o corelație inversă puternică între frecvența celulelor T CD4+ infectate care conțin ADN proviral HIV-1 și raportul dintre celulele T CD4+ și CD8+, sugerând că nivelurile scăzute de replicare virală reziduală pot fi parțial responsabile de raportul anormal dintre celulele T CD4+:CD8+ din sângele periferic.

Deși frecvența celulelor T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 poate fi direct asociată cu raportul dintre celulele T CD4+:CD8+, alți factori pot afecta această relație. Parametrii precum existența unor rezervoare virale necunoscute care susțin replicarea virală activă în prezența HAART, anomalii ale sistemului imunitar al gazdei, potența regimurilor terapeutice date sau alți factori de confuzie pot avea un efect atât asupra CD4+: Raportul dintre celulele T CD8+ și încărcăturile de ADN proviral în compartimentul celulelor T CD4+. De remarcat, datele noastre sugerează că replicarea virală continuă la niveluri care nu sunt detectabile prin testele standard pentru viremia plasmatică, dar care mențin rezervorul de celule T CD4+ al HIV-1, deși sunt suficiente pentru a împiedica normalizarea numărului de celule CD4+: Raporturile de celule T CD8+ la pacienții examinați în acest studiu, nu sunt suficiente pentru a menține răspunsurile CTL specifice HIV-1.

Se poate argumenta că raporturile anormale susținute ale celulelor T CD4+:CD8+ la persoanele infectate care primesc HAART pentru perioade prelungite ar putea fi, de asemenea, atribuite atât unor factori imunologici, cât și virologici. În acest sens, s-a demonstrat că, în absența progresiei bolii și a unei recuperări suficiente a celulelor T CD4+, homeostazia totală a celulelor T este menținută la persoanele infectate prin niveluri ridicate de celule T CD8+ care, la rândul lor, pot interfera cu regenerarea celulelor T CD4+ . Cu toate acestea, nu am găsit o corelație între nivelurile de celule T CD4+ purtătoare de ADN proviral HIV-1 și numărul de celule T CD8+.

În cele din urmă, studiile anterioare au arătat că generarea de celule T CD4+ în timus este grav împiedicată de consecințele directe sau indirecte ale replicării virale active . În acest sens, la indivizii infectați au fost demonstrate niveluri scăzute ale producției timice, măsurate prin frecvența celulelor T CD4+ naive CD4+ purtătoare de cercuri de excizie de rearanjare a receptorilor de celule T . Deși nu este clar dacă precursorii celulelor T CD4+ sunt infectați de HIV-1 în timus, datele noastre sugerează cu tărie că suprimarea incompletă a replicării virale la persoanele infectate care primesc HAART continuă să răspândească infecția în compartimentul celulelor T CD4+ din sângele periferic, ceea ce duce la menținerea rezervorului de celule T CD4+ pentru HIV-1.

Recunoștințe

Le mulțumim lui Paul Parks pentru programarea vizitelor pacienților, lui Susan Moir pentru citirea acestui manuscris și pentru discuțiile utile, precum și pacienților pentru participarea lor la acest studiu.

Figuri și tabele

.