Solution structure, specificitatea glicanică și activitatea inhibitoare a fenol-oxidazei a lectinelor de tip C din Anopheles CTL4 și CTLMA2

Conservarea CTL4/CTLMA2 în Anopheles

CTL4 și CTLMA2 constau ambele dintr-o peptidă semnal, o scurtă secvență N-terminală care conține motivul CXCXC și un singur domeniu CTL. Un raport recent a sugerat că funcția CTL4 și CTLMA2 sau a cofactorilor lor au deviat în cadrul Anopheles și, în special, că An. albimanus CTL4 nu conține reziduurile de cisteină N-terminale implicate în legăturile disulfidice22. Am reexaminat mai întâi ortologii CTL4 (AGAP005335) și CTLMA2 (AGAP005334), care au o orientare strânsă spate în spate pe cromozomul 2L (Fig. 1a), utilizând modelele actuale de gene (din februarie 2019) în Vectorbase24. Am găsit proteine cu un motiv CXCXC N-terminal pentru 15/16 ortologii CTL4, inclusiv An. albimanus AALB014534, și 13/14 ortologii CTLMA2. Am efectuat alinieri de secvențe multiple atât ale CTL4, cât și ale CTLMA2 de la 10 specii de Anopheles din Asia, Africa și Lumea Nouă (Fig. 1b). Arborii filogenetici neînrădăcinați au o topologie aproape identică, iar un arbore filogenetic combinat are două ramuri simetrice, cu excepția poziției lui An. dirus în raport cu An. funestus și An. maculatus.

Acest lucru susține ipoteza că CTL4 și CTLMA2 sunt conservate în cadrul genului Anopheles, ortopologii lipsă reflectând adnotarea incompletă a anumitor genomuri. Am examinat regiunea genomică a trei specii cu un ortolog CTL4 raportat, dar fără ortolog CTLMA2: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 și An. melas AMEC014491. Toate posedă o genă apropiată sau suprapusă în orientare inversă – ASTE002636, AMIN007379 și AMEC088499, care cuprinde două domenii CTL. Pentru An. stephensi și An. minimus, cel de-al doilea CTL este precedat de un motiv CXCXC, ceea ce sugerează că acestea ar putea fi ortologii CTLMA2. La țânțarii Aedes și Culex, situația este mai puțin clară. Un ortolog CTLMA2 care include un motiv CXCXC N-terminal este adnotat la Ae. albopictus, AALF001196, și are o genă inversată spate în spate apropiată, cu doi exoni, AALF001195, care cuprinde o serin protează și un domeniu CTL. Modelul de gene din octombrie 2018 pentru Ae. aegypti include un ortolog CTLMA2 cu motiv CXCXC N-terminal, CTLMA14 (AAEL014382), listat în prezent ca un ortolog CTL4). Un ortolog CTLMA2 este notat la C. quinquefasciatus, CPIJ000443, dar este lipsit de motivul CXCXC N-terminal. Acest lucru sugerează că CTLMA2 a apărut într-un strămoș comun al Anopheles și Aedes, în timp ce CTL4 poate fi specific Anopheles.

Caracterizare biochimică

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 și CTLMA2 CRD (Fig. S1a) și An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) au fost exprimate în celule de insecte utilizând sistemul de vectori de expresie baculovirus (BEVS) și purificate până la omogenitate. AgCTL4 matur (25-177) are o masă molară de 17,3 kDa și pI 7,7. AgCTLMA2 matur (18-174) are o masă molară de 17,9 kDa și pI 4,5. Heterodimerul purificat are o greutate moleculară pe SDS-PAGE nereducătoare (NR) de 35 kDa (Fig. 2a) și se eluează ca un singur vârf pe cromatografia de excludere a dimensiunii (SEC) cu o greutate moleculară aparentă de 40 kDa (Fig. 2b). CTL4 și CTLMA2 monomerice apar pe SDS-PAGE reducător la 17 kDa și, respectiv, 20 kDa. După cum s-a menționat anterior, greutatea moleculară aparentă crescută a CTLMA2 poate reflecta distribuția neobișnuită (acidă) a aminoacizilor săi20.

S-a demonstrat că An. gambiae CTL4/CTLMA2 este stabilizat de o disulfură intermoleculară între cisteinele motivului CXCXC N-terminal; mutația acestor trei cisteine în alanină abrogă formarea disulfurii între lanțuri20. Pentru a preciza în continuare localizarea disulfurii intercatene, am construit nouă mutanți care conțin o singură cisteină în motivul CXCXC N-terminal al CTL4 și CTLMA2, am coexprimat proteinele în celule Sf9 și am efectuat Western Blotting pentru a detecta CTL4 și CTLMA2. Formarea disulfidelor intermoleculare a fost ineficientă, dar evidentă pe SDS-PAGE nereducătoare în toate cazurile (Fig. 2c).

Acest lucru sugerează că formarea disulfidelor intermoleculare N-terminale între CTL4 și CTLMA2 este promiscuă, mai degrabă decât să implice un reziduu de cisteină specific din fiecare proteină. În cazul în care formarea disulfurii intermoleculare este promiscuă, heterodimerii CTL4/CTLMA2 ar putea, în principiu, să formeze oligomeri multivalenți legați prin disulfură. Cu toate acestea, nu se detectează oligomeri legați prin disulfură pe NR-SDS-PAGE pentru An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Fig. 2a). În mod similar, în timp ce CTL4 și CTLMA2 pot forma homodimeri cu punte de disulfură in vitro20, produsul purificat este în proporție covârșitoare (>95%) heterodimer. Unele benzi minore (~10%) sunt observate pe NR-SDS-PAGE pentru An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) care pot reprezenta formarea de homodimeri sau oligomeri.

Atât An. gambiae CTL4/CTLMA2, cât și An. albimanus CTL4/CTLMA2 sunt polidisperse în soluție. Oligomerizarea necovalentă de ordin superior este evidentă ca un umăr al vârfului principal în SEC, odată cu creșterea concentrației, și este mai pronunțată pentru An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Am confirmat existența speciilor oligomerice prin ultracentrifugare analitică cu viteză de sedimentare (AUC) (Fig. 2d). La pH 7,5 se observă o serie de specii de intensitate descrescătoare în distribuția c(s): s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomerizarea este independentă de Ca2+ pentru A. gambiae CTL4/CTLMA2, dar crește substanțial cu Ca2+ pentru A. gambiae CTL4/CTLMA2, dar crește substanțial cu Ca2+ pentru A. gambiae CTL4/CTLMA2. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), și nu este corelată cu pH-ul conform împrăștierii dinamice a luminii (DLS) (Fig. 2e).

Fixarea calciului

Ca CTL-uri, atât CTL4 cât și CTLMA2 pot lega calciul. Cu toate acestea, reziduurile canonice de legare a Ca2+ în CTL4 sunt mutate, sugerând că ar putea fi un CTLD, dar nu un CRD de tip C. Prin urmare, am măsurat afinitatea de legare a calciului a CTL4 și CTLMA2 din An. gambiae și a heterodimerului CTL4/CTLMA2 din An. gambiae și An. albimanus prin calorimetrie de titrare izotermă (ITC). În condiții echivalente, s-a observat o legare pentru CTLMA2 și CTL4/CTLMA2, dar nu și pentru CTL4 (Fig. 3a-c). Constantele de legare și parametrii termodinamici au fost calculați din rezultatele a trei experimente independente (tabelul 1). Legarea CTLMA2 Ca2+ se potrivește bine cu un model cu un singur situs cu KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. Afinitatea An. gambiae CTL4/CTLMA2 pentru calciu este ~40 × mai mare decât cea a CTLMA2 cu KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) are o afinitate similară pentru calciu cu KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Cu toate acestea, legarea calciului atât la An. gambiae cât și la An. albimanus CTL4/CTLMA2 a fost sub-stoichiometrică (N = 0,36-0,50).

Legătură glicanică

CTL4 și CTLMA2 aparțin liniei de CTL mieloide – inclusiv receptorul de manoză macrofagică (MMR) și DC-SIGN – care formează o familie conservată de receptori imuni la metazoare15,25. Dintre CTL cu structură cunoscută, CTLMA2 are o identitate de secvență de 30 % cu domeniul de recunoaștere a carbohidraților (CRD) al receptorului scavenger de șoarece (SCRL, PDB ID 2OX9)26 și cu proteina surfactantă porcină D (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 conservă reziduurile asociate cu legarea Ca2+ în bucla de legare a glicanului și motivul EPN canonic asociat cu selectivitatea D-mannozei (Fig. 4a). În schimb, CTL4 este lipsit de toate reziduurile asociate cu legarea de Ca2+, în concordanță cu faptul că nu s-a observat nicio legare prin ITC. Singura CTL de structură cunoscută cu o similitudine considerabilă cu CTL4 este proteina de legare a factorului IX/X (X-bp) din veninul mocasinului chinez Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp este o CTLD modificată în care domeniul de legare a glicanilor este înlocuit cu o buclă lungă care mediază dimerizarea pentru a genera situsul de legare a factorului IX/X. Prin urmare, deși unele CTL-uri de insecte nu au nevoie de calciu pentru legarea glicanilor, nu este clar dacă CTL4 ar trebui să lege glicani deloc.

Pentru a le defini activitatea de lectină, am analizat CTL4, CTLMA2 și heterodimerul CTL4/CTLMA2 pe rețele de glicani care prezintă 367 de structuri glicanice unice28. Aceste studii au demonstrat legarea la o serie de glicani (tabelul 2). Monomerii CTL4 și CTLMA2 au demonstrat că se leagă la numai patru și, respectiv, șase glicani, în timp ce heterodimerul s-a legat la 18 glicani diferiți. Există o diferență apreciabilă între liganzii legați de monomerii individuali și de heterodimer; 3/4 (75 %) dintre glicanii recunoscuți de CTL4 și 2/6 (33 %) dintre glicanii recunoscuți de CTLMA2 nu au fost recunoscuți de CTL4/CTLMA2.

Pentru a confirma rezultatele matricei de glicani și pentru a determina preferințele de legare pentru CTL-uri, s-a efectuat analiza SPR (tabelul 3). În aproape toate interacțiunile, matricea glicanică și SPR au fost în acord pentru prezența interacțiunilor, SPR indicând că matricea glicanică a avut patru rezultate fals negative: CTLMA2 monomer cu H-antigen, sulfat de condroitină și condroitin-6-sulfat, și CTL4 monomer cu condroitin-6-sulfat. Cu toate acestea, toate rezultatele fals negative au arătat legarea pe matrice cu heterodimerul CTL4/CTLMA2.

CTL-urile nu au recunoscut glicani care conțin mannoză, cu excepția mannozei-6-fosfat de către CTL4/CTLMA2, în ciuda motivului EPN canonic prezent în CTLMA2. Mai degrabă, structurile recunoscute sunt, în general, motive glicozaminoglicanice (GAG) care cuprind legături β1-3/β1-4 între glucoză (Glc), galactoză (Gal) și hexosaminele lor respective GlcNac și GalNac. Legătura Galβ1-4Glc a fost prezentă în 12/23 (52%) dintre glicanii recunoscuți, inclusiv 6/23 (26%) care conțin Galβ1-4GlcNac și 4/23 (17%) care conțin motivul keratan Galβ1-4GlcNac β1-3Gal sau GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

De asemenea, matricea a arătat o anumită preferință pentru glicanii polimerici și sulfatați. Dintre cei patru glicani recunoscuți de CTL4, cel mai puternic rezultat a fost pentru globopentază (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 a legat, de asemenea, HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n și β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Trei dintre cei cinci glicani recunoscuți de monomerul CTLMA2 au fost sulfatați, iar heterodimerul CTL4/CTLMA2 a recunoscut sulfatul de condroitină și condroitin-6 sulfat, acidul hialuroninc (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 și HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Aceste rezultate sugerează că există efecte distincte și sinergice ale heterodimerizării asupra legării glicanilor.

Atât CTLMA2, cât și heterodimerul CTL4/CTLMA2 recunosc mai multe zaharuri care conțin fucose, inclusiv sialil-LewisX și sulfo-LewisA, dar nu și sialil-LewisA. Cea mai mare afinitate de legare a fost observată pentru sulfo-LewisA cu legare la complexul CTLMA2 (106 nM) și CTL4/CTLMA2 (95 nM) la un KD de ~100 nM (tabelul 3). Cea mai mare afinitate de legare observată pentru CTL4 a fost, de asemenea, pentru un glican sulfat, sulfo-lactosamina (292 nM).

Analiză structurală

Pentru a cerceta în continuare structura CTL4 și CTLMA2, am generat modele structurale ale CTL4 și CTLMA2 (Fig. 4b) folosind MODELLER29 cu editare manuală suplimentară. Atât CTL4, cât și CTLMA2 au o buclă extinsă (buclă 1) care urmează cea de-a doua helixă a CTLD (Fig. 4a) cu o densitate mare de reziduuri încărcate complementare; reziduuri bazice pentru CTL4 și reziduuri acide pentru CTLMA2. Electrostatica complementară a acestor reziduuri din bucla 1 și apropierea lor de motivul CXCXC N-terminal sugerează că aceasta este o potențială interfață proteină/proteină în cadrul heterodimerului (Fig. 4b), pentru care a fost generat un model ipotetic cu o singură legătură disulfură în motivul CXCXC. Cu toate acestea, buclele de legare a glicanului/Ca2+ reprezintă o a doua interfață potențială, așa cum s-a observat pentru cele două lanțuri de X-bp din D. acutus. Ipoteza alternativă este că cele două domenii CTL sunt independente una de cealaltă, cu legături flexibile care le unesc prin intermediul ipotezei intermoleculare.

Pentru a testa această ipoteză, am analizat structura în soluție a CTL4/CTLMA2 prin împrăștiere de raze X în unghi mic (SAXS). Experimentele au fost efectuate în 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 și 1% glicerol pentru a minimiza interacțiunile interparticulare. În aceste condiții, proteina a prezentat o relație liniară între intensitatea extrapolată la unghiul zero și concentrație (I0 vs. c) până la o concentrație de 3,1 mg/ml. Curba de intensitate I vs. q sustrasă din tampon (Fig. 4c) a fost supusă la SAXSMoW2 care a dat RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) și o greutate moleculară MW = 39 kDa, cu doar 11% mai mare decât MW-ul așteptat al heterodimerului de 35 kDa30. Cu toate acestea, graficul Guinier calculat se bazează pe numai șapte puncte de date; potrivirea pe un interval extins (Fig. 4c, inset) produce RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), în timp ce potrivirea funcției de distribuție pe perechi P(r) (Fig. 4d) produce un RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). Distribuția P(r) ajustată de DAMMIF31 cu 20 de modele de mărgele ab initio cu o discrepanță structurală normalizată medie NSD = 1,0 ± 0,2. Corpul principal al modelelor ab initio sunt similare ca formă cu heterodimerul CTL4/CTLMA2 așteptat.

Densitatea suplimentară se extinde din corpul principal al modelelor de mărgele care poate reflecta fie secvența N-terminală a ambelor proteine, inclusiv motivul CXCXC, fie o populație minoră de CTL4/CTLMA2 cu o rază de girație mai mare. Pentru a testa această ipoteză, am realizat modelarea în mai multe stări a profilului SAXS cu ajutorul programului MULTIFOXS32. Am generat un model complet pentru CTL4-6xHis/CTLMA2 cu o spirală spiralată N-terminală terminată de o disulfură intermoleculară între CTL4 C39 și CTLMA2 C34. MULTIFOXS a generat un ansamblu de 10.000 de variante ale modelului pentru a le compara cu curba de dispersie experimentală. Singurele reziduuri flexibile au fost CTL4 40-45 și 178-183 (6xHis) și CTLMA2 35-39, cu o spirală spiralată N-terminală care servește ca un corp rigid care conectează cele două lanțuri. Cel mai bun model cu o singură stare s-a potrivit datelor cu χ2 = 1,13 și a avut RG = 23,7 Å. Minimul χ2 = 1,07 a fost obținut cu un model cu 3 stări (Fig. 4e), în care 80% din împrăștiere este contribuită de două modele compacte cu RG = 22,0 Å și RG = 23,7 Å. Aceste date sunt în concordanță cu formarea unui heterodimer compact între CTL4 și CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 inhibă activarea fenol oxidazei ca răspuns la E. coli

CTL4 și CTLMA2 funcționează ca inhibitori ai răspunsului de melanizare a țânțarilor la infecție. S-a raportat anterior că blocarea CTL4 nu a dus la creșterea activității fenol oxidazei (PO) ca răspuns la infecția cu un amestec de E. coli și S. aureus20. Cu toate acestea, același studiu a constatat că țânțarii dsCTL4 și dsCTLMA2 au fost în mod specific sensibili la bacteriile Gram-negative. Prin urmare, am reexaminat efectul reducerii CTL4 și CTLMA2 asupra activității PO din hemolimfă ca răspuns doar la infecția cu E. coli (Fig. 5a). La 4 h după infecția cu E. coli, activitatea PO a fost semnificativ îmbunătățită pentru țânțarii dsCTL4 (p = 0,02) și dsCTLMA2 (p = 0,004) în comparație cu controalele dsLacZ (Fig. 5b). Eficiența medie de knockdown pentru CTL4 și CTLMA2 a fost de 93 ± 3 % și, respectiv, 89 ± 3 %, cu >80 % în orice experiment unic.

Melanizarea ookinților Plasmodium la reducerea la tăcere CTL4/CTLMA2 este dependentă de LRIM117,22, TEP133 și SPCLIP133. Deoarece toate acestea sunt elemente ale răspunsului imunitar asemănător complementului TEP1, am dedus că activitatea PO îmbunătățită în absența CTL4 ar trebui să fie dependentă de TEP1. În consecință, am comparat intensificarea activității PO la țânțarii dsCTL4 cu coadministrarea de dsTEP1 cu coadministrarea de dsLacZ (Fig. 5c). Eficiența medie de knockdown pentru TEP1 a fost de 82 ± 9 % și >80 % în 5/6 experimente (64 % într-un experiment). Într-adevăr, nu a existat o intensificare semnificativă a activității PO la țânțarii dsCTL4 atunci când TEP1 a fost, de asemenea, redus la tăcere. Acest lucru confirmă faptul că melanizarea în absența CTL4/CTLMA2 este dependentă de TEP1.

Co-administrarea de CTL4/CTLMA2 recombinant cu E. coli a inversat în mod semnificativ intensificarea activității PO la țânțarii dsCTL4 în comparație cu BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Aceste rezultate demonstrează că CTL4/CTLMA2 este implicat direct ca regulator negativ al activității PO. Cu toate acestea, la țânțarii dsLacZ, CTL4/CTLMA2 nu a suprimat activitatea PO indusă de E. coli în comparație cu albumina serică bovină (BSA). De asemenea, activitatea PO indusă de E. coli la țânțarii dsCTL4 coinjectați cu CTL4/CTLMA2 recombinant (dsCTL4 + CTLs) a fost mai mare decât cea a țânțarilor dsLacZ coinjectați cu BSA (dsLacZ + BSA). Prin urmare, injectarea de CTL4/CTLMA2 recombinante nu salvează complet pierderea proteinei endogene.

.