De la descoperirile seminale ale principiilor de bază care stau la baza clonării moleculare, au fost dezvoltate o serie de strategii de clonare pentru a îmbunătăți ușurința și viteza cu care fragmentele de ADN pot fi recombinate. Citiți despre cele mai comune strategii utilizate în clonarea moleculară sau obțineți gena dorită în vectorul dorit în mod simplu cu ajutorul clonelor GenEZ™ ORF. Începeți cu o căutare a genei dumneavoastră.
Clonarea tradițională
Clonarea tradițională, numită și clonare PCR, necesită utilizarea reacției în lanț a polimerazei (PCR) pentru a amplifica secvența șablon de interes (de obicei, gena de interes) și adăugarea de situsuri de restricție la capetele secvenței. Enzimele de restricție sunt utilizate pentru a tăia atât șablonul de interes, cât și vectorul țintă, iar ligazele ADN sunt utilizate pentru a uni capetele lipicioase ale șablonului și vectorului. Clonarea tradițională permite manipularea flexibilă a secvenței de ADN, ceea ce facilitează construirea aproape a oricărei construcții dorite. Cu toate acestea, punctele de control și procedurile de optimizare necesare pentru clonarea tradițională pot fi greoaie, iar reactivii necesari pot fi costisitori.
Clonarea TA
Clonarea TA este una dintre cele mai simple forme de clonare. În această metodă, se folosesc vectori care conțin supraînălțări de timină 5′ pentru a accepta produse PCR în care au fost adăugate supraînălțări suplimentare de adenozină 3′ prin natura amplificării TAQ polimerazei. Clonarea TA are avantajul ușurinței și vitezei, deoarece nu este necesară nicio etapă de digestie de restricție. În plus, kiturile de clonare TA conțin tampoane de reacție care conțin vectorul preamestecat, ligazele și tamponul, reducând timpul de reacție de ligare la doar 5 minute. Dezavantajul tehnologiei de clonare TA constă în faptul că clonarea nu este direcțională, ceea ce înseamnă că gena de interes poate fi inserată în vectorul țintă fie în sens, fie în sens invers. În mod normal, jumătate din transformanții următori vor conține gena în direcția sens și jumătate vor conține gena în direcția antisens. Cu toate acestea, celulele transformate cu gene toxice pot prezenta toate genele în direcția antisens, deoarece celulele care conțin genele orientate în sens nu vor supraviețui. În plus, celulele supraviețuitoare care conțin gene toxice orientate în direcția sens pot suferi mutații pentru a codifica o proteină mai puțin toxică.
Clonarea fără sudură
Tehnologiile de clonare fără sudură elimină cerința enzimelor de restricție. Acest lucru poate fi avantajos atunci când o inserție conține un număr de situsuri de restricție în cadrul secvenței sale, ceea ce face difficilă identificarea enzimelor de restricție care nu vor tăia gena de interes în timpul procedurii de clonare. Clonarea fără sudură profită de recombinarea omoloagă și există numeroase variante ale acestei tehnici. În general, procedura constă în adăugarea de secvențe flanking cu o lungime de aproximativ 15 bp atât la inserție, cât și la vector prin PCR. Exonucleazele sunt utilizate pentru a mesteca înapoi secvențele insertului și ale vectorului, iar ADN-ul este unit cu ajutorul enzimelor recombinazei sau al ligazei ADN. Clonarea fără cusur a fost simplificată prin dezvoltarea de kituri care conțin deja vectorul țintă și un amestec brevetat de enzime necesare pentru reacția de recombinare. De exemplu, kitul GenBuilder™ de la GenScript poate clona inserții de până la 10 kb în 30 de minute și poate fi utilizat, de asemenea, pentru proiecte de clonare de mare randament.
.