Materiale:
30ml de cultură exponențială de celule SF9 la 5×105 celule/ml
6 plăci cu godeuri (câte 2 de fiecare)
1borcan de gel de agaroză 4%
1borcan SF-900 (1.3X) mediu
1borcan steril
0,5ml supernatant baculovirus
100ml SFM
1. În condiții de sterilitate se distribuie 2 ml de suspensie celulară pe puț.
2. Se lasă celulele să se așeze pe fundul plăcii și se incubează, acoperite, la RT timp de 1h.
3. Se plasează flaconul de gel de agaroză în baia de apă la 70oC. Se plasează flaconul gol și SF-900 (1.3X) în baia de 40oC.
4. După o oră de incubare a plăcilor la RT, se observă monostraturile la microscopul inversat pentru a confirma atașarea celulelor și o confluență de 50%.
5. Produceți o diluție în serie de opt loguri a supranaturalului viral recoltat prin diluția succesivă a 0,5 ml din diluția anterioară în 4,5 ml de mediu SFM în 12 recipiente de 12 ml. Ar trebui să încheiați cu 8 tuburi care să conțină fiecare câte o diluție de la 10-1 la 10-8 din stocul inițial de virus.
7. Îndepărtați secvențial supernatantul din fiecare gode, aruncați-l și înlocuiți-l imediat cu 1 ml din diluția virală respectivă în fiecare gode duplicat. Se incubează timp de 1h laRT.
8. Se mută flacoanele din baia de apă în hota sterilă atunci când agaroza este lichidă (20-30 minute).Se distribuie rapid 30 ml de mediu SF-900 (1,3X) și 10 ml de gel de agaroză 4% în flaconul gol și se amestecă ușor. Reîntoarceți flaconul de plaquing overlayîn baia de apă la 40oC până la utilizare.
9. În urma acestei a doua incubări de 1h, readuceți flaconul de agaroză diluată și plăcile cu 6 godeuri în hotă.
10.În mod secvențial (de la diluția mare la cea mică), îndepărtați virusul din godeuri și înlocuiți-l cu 2 ml de agaroză diluată. Lucrați rapid pentru a evita desecarea monostratului.O pipetă Pasteur conectată la o pompă de vid îndepărtează cu ușurință urmele de inocul.
11.Lăsați gelul să se întărească timp de 10 până la 20 min înainte de a trece.
12.Incubați la 27oC într-un incubator umidificat timp de 4 până la 10 zile.
13.Virusul recombinant produce plăci lăptoase/gri de un ușor contrast, vizibile fără colorare sau alte metode de detectare.
14.Monitorizați plăcile zilnic până când numărul de plăci numărate nu se modifică timp de două zile consecutive.
15.Pentru a determina titrul inoculului utilizat, un interval optim de numărare este de 3 până la 20 de plăci pe puțul unei plăci cu 6 puțuri. Titrul (pfu/ml) poate fi calculat prin următoarea formulă:
16. Suprapunerea agarozei cu colorantul Natural Red:
Pregătiți o soluție de agaroză 0,5% în SFM
Adaugați soluția Natural Red la o concentrație finală de 50mg/ml (diluați 3,33mg/ml stoc 1:66,6).
Suprapuneți 1ml de soluție de colorant în fiecare gode (pe o placă cu 6 godeuri).
.