Tumor Xenograft

Caracterizarea băncilor de xenogrefe

Lucrul cu tumori PDX necesită crearea și întreținerea unei bănci de tumori, care sunt implantate la șoareci și apoi transferate în serie de la o generație la alta, cu excepția cazului în care acest lanț de evenimente este întrerupt de înghețarea probelor. Se consideră că PDX reproduc caracteristicile morfologice ale tumorii originale mai precis decât xenogrefele de linii celulare stabilite, în ceea ce privește profilul histologic și genetic. Acestea reproduc eterogenitatea cancerelor umane și au o valoare mai bună pentru a prezice răspunsul la tratament.8-16

Leziunile inflamatorii sunt, în general, ușor de identificat prin metode histologice. În schimb, în cazul tumorilor, poate fi mai dificil de determinat dacă tumora este cea așteptată sau are o origine diferită. Într-adevăr, tumorile murine se pot dezvolta la locul xenogrefelor. Cele mai multe astfel de tumori sunt limfoame (Fig. 4.2B)11 , dar uneori se observă sarcoame cu celule fusiforme (Fig. 4.2C) și, în cazuri rare, pot fi observate și alte tumori murine, cum ar fi tumori ale glandei mamare în țesutul subcutanat al șoarecilor femele. Tumori spontane sau leziuni asemănătoare tumorilor se pot dezvolta, de asemenea, în organe îndepărtate și pot fi interpretate greșit ca posibile metastaze (de exemplu, adenoame pulmonare; Fig. 4.2D). Simpla examinare morfologică a țesutului indică, în general, în mod clar dacă tumora este de același tip cu tumora umană originală. Acest lucru este valabil în special pentru majoritatea xenogrefele de carcinom, care au o morfologie foarte diferită de cea a limfoamelor sau sarcoamelor. Carcinoamele sunt, în general, formate din celule mari, clar dispuse în cordoane, tubuli sau lobuli cu un interstițiu conjunctiv proeminent. Limfoamele (fie ele umane sau murine) sunt formate din foițe de celule mici și rotunde, cu stromă rară, iar sarcoamele sunt formate din fluxuri de celule fusiforme. Prin urmare, este ușor de distins cu ochiul liber între aceste tipuri diferite de tumori. Diagnosticul poate fi mai dificil în cazul în care tumora inițială este o „tumoare albastră”, o tumoare formată din celule mici cu foarte puțină citoplasmă și un nucleu hipercromatic, care apare profund bazofilă (de culoare albastră) la microscop la o mărire mică în urma colorației cu hematoxilină și eozină (H&E). Tumorile blastice, cum ar fi retinoblastomul, sunt de obicei tumori albastre. În astfel de cazuri, morfologia tumorii poate fi dificil de interpretat, mai ales că cele mai specifice caracteristici ale unor tumori, cum ar fi rozetele din multe tumori blastice, lipsesc în general sau sunt slab reprezentate în xenogrefe. Tumorile anaplazice, în care celulele tumorale au o asemănare morfologică mică sau deloc cu celulele normale, pot fi, de asemenea, dificil de caracterizat fără tehnici auxiliare. După cum s-a afirmat, în timp ce este relativ ușor de diferențiat sarcomul de limfom sau de carcinomul bine diferențiat, diferențierea xenogrefele de sarcom de leziunile inflamatorii sau de sarcoamele murine poate fi dificilă, deoarece aceste leziuni pot avea o morfologie foarte asemănătoare.6

Când avem de-a face cu cazuri dificile sau pur și simplu pentru a confirma că o tumoare este într-adevăr de origine umană înainte de a începe un experiment, se pot utiliza mai multe metode diferite concepute pentru a evidenția proteine sau secvențe de nucleotide specifice speciei, bazate pe imunohistochimie sau hibridizare in situ, pentru a identifica celulele umane sau murine. Caracterizarea imunohistochimică a proteinelor caracteristice unei linii celulare este utilă pentru a preciza țesutul de origine al tumorii.

Ar trebui să se acorde o atenție deosebită posibilei dezvoltări a limfoamelor umane la locul de grefare a tumorilor nelimfoide, mai ales în timpul implantării inițiale.11 Astfel de tumori poartă markerii specifici ai celulelor umane; acest lucru poate duce la confuzie cu o adevărată xenogrefă dacă nu se efectuează o examinare morfologică a leziunii. În studiile PDX, majoritatea limfoamelor umane observate par să se dezvolte din limfocitele prezente în proba de țesut utilizată pentru grefa inițială. Dacă aceste celule sunt infectate cu virusul Epstein-Barr (EBV), limfocitele B pot suferi transformări pentru a deveni celule tumorale.17,18 Aceste celule sunt eliminate în mod eficient de sistemul imunitar la oamenii imunocompetenți, în timp ce grefarea lor la șoarecii imunocompromiși permite dezvoltarea celulelor B maligne și luarea locului tumorii umane inițiale.11 Câteva cazuri de limfoame cu celule T periferice umane EBV-negative au fost, de asemenea, descrise în contextul PDX.19 Dacă tumora umană inițială era în mod clar diferită de limfom (de exemplu, un adenocarcinom), atunci dezvoltarea unui limfom uman este ușor de gestionat, deoarece o simplă examinare morfologică este suficientă pentru a arăta că tumora care crește la locul de grefare nu este de tipul așteptat și, prin urmare, ar trebui să fie eliminată. În cazul în care tumora inițială a fost o „tumoare albastră”, atunci demonstrarea faptului că tumora găsită la locul de grefare este de origine umană poate duce la interpretări eronate în absența unei caracterizări suplimentare, deoarece această tumoare poate fi, de fapt, un limfom uman rezultat din transformarea malignă a limfocitelor infectate cu EBV prezente în tumora inițială, după cum s-a discutat anterior.

Când se stabilește o xenogrefă (în general, se consideră că tumorile PDX sunt stabilizate după trei până la cinci treceri20), aceasta ar trebui să fie caracterizată, atât din punct de vedere al tipului histologic, cât și al diferențierii sale. Tipul histologic al tumorii este, în general, bine conservat în xenogrefe, astfel încât carcinoamele epidermoide și adenocarcinoamele tubuloase, de exemplu, au aceleași caracteristici atunci când formează PDX.21 Se consideră că această stabilitate fenotipică este legată de stabilitatea biochimică, deoarece este puțin probabil ca modificările biochimice marcate să ducă la păstrarea caracteristicilor morfologice.6 Prin urmare, prima întrebare pe care trebuie să o adreseze patologul este dacă tumora prezentă reproduce caracteristicile morfologice și biochimice ale țesuturilor părintești.17 În caz contrar, este posibil să corespundă unei tumori murine sau să fi existat o schimbare majoră în modelul de diferențiere a tumorii, ceea ce ar necesita investigații suplimentare.8

Cu toate acestea, în unele dintre transplanturile de primă generație și din ce în ce mai mult după alte treceri, unele tumori pot avea tendința de a deveni mai puțin diferențiate, cu mai puține canale sau acini în adenocarcinoame și rate mai mari de mitoză, pleomorfism nuclear și atipie.20

Detalii morfologice specifice se pot schimba în timpul trecerilor în serie, cu dobândirea secreției de mucină sau a diferențierii neuroendocrine, de exemplu, ambele fiind criterii de progresie tumorală în unele carcinoame (de exemplu, cancerele de prostată).22 În mod similar, modelul de diferențiere tumorală poate fi alterat de modificări ale condițiilor de grefare, cu modificări ale statusului hormonal al gazdei datorate castrării sau suplimentării hormonale, de exemplu.22

Determinarea faptului dacă morfologia tumorii este păstrată după grefare, treceri în serie sau experimente reprezintă una dintre dificultățile cu care se confruntă patologii. Într-adevăr, xenogrefele independente din aceeași tumoare nu sunt niciodată strict identice, din cauza variabilității biologice și a eterogenității intratumorale. Chiar și secțiuni diferite ale aceleiași tumori și regiuni diferite ale aceleiași secțiuni pot prezenta diferențe morfologice. Caracteristicile morfologice ale celulelor și ale nucleelor acestora, dispunerea lor spațială, indicele mitotic și prezența mitozelor atipice, numărul de corpuri apoptotice și frecvența necrozei, abundența stromei și vasculatura diferă de la o secțiune la alta și de la un câmp la altul. Patologul trebuie, prin urmare, să determine dacă modelul global al tumorii este păstrat și, mai important, dacă histologia tumorii xenotransplantate se potrivește cu cea a tumorii originale a donatorului. Clasificările internaționale ale tumorilor umane ar trebui utilizate ca bază pentru o clasificare patologică precisă a xenogrefelor, dar este necesar un anumit grad de flexibilitate, deoarece xenogrefele nu reproduc niciodată perfect morfologia tumorii umane originale.

Când xenogrefele sunt urmărite pe parcursul unor treceri succesive sau în timpul experimentelor, schimbările calitative, cum ar fi trecerea de la un model trabecular la unul tubular, dacă sunt reproductibile, pot fi considerate semnificative, în timp ce schimbările cantitative, cum ar fi alterarea indicelui mitotic sau a cantității de necroză, în special dacă sunt subtile, trebuie interpretate cu mare precauție.

O altă dificultate în analizele histologice ale xenobăncilor tumorale rezultă din natura parțial subiectivă a analizei morfologice. Dacă observatorii cunosc bine morfologia unui anumit tip de tumoare, atunci percepția lor este fin reglată pentru a detecta mici detalii care pot deveni mai evidente cu timpul. Este recomandabilă selectarea unui eșantion de PDX stabilizat care să fie utilizat ca referință, pentru a fi comparat cu eșantioane noi, pentru a se asigura că lamelele sunt citite cât mai obiectiv posibil. O bancă digitală de lame virtuale poate facilita foarte mult această sarcină. Dacă nu poate fi detectată nicio diferență evidentă între lamelele de testare și cele de referință, atunci leziunea poate fi considerată „similară”; aceasta nu înseamnă că sunt identice, ci doar că nu pot fi detectate modificări morfologice semnificative.

Pentru prima probă observată într-un experiment de xenogrefă, referința ar trebui să fie o probă a tumorii umane originale sau cel puțin să aibă o descriere morfologică precum tumora în cauză în raportul de patologie al pacientului. Dacă nu este disponibilă o astfel de referință, patologul poate spune pur și simplu că tumora este „compatibilă din punct de vedere morfologic” cu o xenogrefă a unei tumori umane dintr-o anumită categorie.

.