Hej,
Jag ställde min fråga någon annanstans men fick inget svar, så jag vill ställa den här och jag ber om ursäkt för att det verkar vara en dum fråga, för jag är verkligen förvirrad !
Jag läste någonstans en sak som förbryllade mig om cDNA. Jag skulle vilja veta om cDNA är dubbelsträngat eller enkelsträngat?
Jag vet att cDNA är en kopia av mRNA med hjälp av omvänt transkriptas, så teoretiskt sett skulle det vara enkelsträngat, eller har jag fel?
Tack för din feedback
Jag ställde min fråga någon annanstans, men hade inte fått något svar, så jag skulle vilja ställa den här, och jag ber om ursäkt för att det verkar vara en dum fråga, för jag är verkligen förvirrad !
Jag läste någonstans en sak som gjorde mig konfunderad när det gäller cDNA. Jag skulle vilja veta om cDNA är dubbelsträngat eller enkelsträngat?
Jag vet att cDNA är en kopia av mRNA med hjälp av omvänt transkriptas, så teoretiskt sett skulle det vara enkelsträngat, eller har jag fel?
Tack för din feedback
För de flesta fall, t.ex. RT-PCR, 3′ eller 5′ RACE, använder vi bara enkelsträngat cDNA (första strängen cDNA), medan vi vid framställning av cDNA för biblioteksbyggande eller RDA/SSH-analyser kan behöva ett ytterligare steg för syntes av andra strängen för att generera dubbelsträngat cDNA.
hi
Du måste skilja på två saker:
cDNA i allmänhet är den DNA-molekyl som ungefär motsvarar mRNA-sekvensen. Det är alltså i de flesta fall en dubbelsträngad molekyl som ingår i plasmid för uttryck.
RT PCR: mRNA-molekylen är omvänt transkriberad till cDNA enkelsträng. Därefter eliminerar RNas mRNA-molekylen och man får en enkelsträngad cDNA-molekyl. Eftersom nästa steg är helt klassisk PCR är en enkelsträng ok för exp (och det första steget, som motsvarar sysnthesis av den motsvarande andra strängen av en DNA-molekyl återställer den riktiga cDNA-molekylen.
För att ha rätt är cDNA en dubbelsträngad molekyl, men för enkelhetens skull används cDNA också för att utforma den omvända transkriberade molekylen i RTPCR. Det bör benämnas som halvt cDNA eller enkelsträngigt cDNA.
cDNA är en förkortning.
I de flesta fall definieras cDNA, som är en förkortning av komplementärt DNA, som en enkelsträngad DNA-molekyl med en nukleotidsekvens som är komplementär till en RNA-molekyl, och som syntetiseras i laboratoriet från mRNA genom omvänd transkription…
Så cDNA är enkelsträngat tills en PCR-reaktion utförs? Ok, i detta fall, hur genererar Taq DNA-polymeras en andra komplementär sträng från en enda sträng? När de två primrarna annealiseras på var sin sida av samma sträng, hur kan de då producera den andra strängen (den nya komplementära strängen)?
I PCR binder en primer till en enkelsträngad bit DNA (därför är det första steget alltid att dentatera vid 94C (eller så) för att separera eventuella dubbelsträngade molekyler till enkelsträngar. När det gäller första strängens cDNA från en RT-reaktion binder endast en primer i den första omgången… Detta innebär att den första förstärkningsomgången i en RT-PCR inte är logrithmisk du syntetiserar helt enkelt den andra strängen av cDNA. I efterföljande omgångar (omgång 2 till omgång n) sker en logrithmisk amplifiering eftersom både den främre och den bakre primern binder till den denaturerade dubbelsträngade mallen.
I den första omgången tror jag att det är den framåtriktade primern som binder… Jag tror att detta beror på att mRNA=framåtriktad sträng i genomet och den första strängen cDNA=komplement till mRNA (eller är detsamma som den omvända strängen i genomet)
Någon som kontrollerar min logik här, jag förvirrar mig själv… stämmer det att mRNA är komplement till den omvända strängen i genomiskt DNA??
Det vill säga: mRNA-sekvens=framåtriktad sträng=5′-3′ sekvens i gDNA (bara med U och inte T)????
HTH
Tack för allt, det är mer klart för mig nu.
Jag tror det, ja, tills man stöter på ett intron, eller hur? 
Vi kan kontrollera någon av dina kända mRNA-sekvenser i NCBI, återskapa den genomiska träffen och jämföra sekvenserna för att se om det är sant eller inte.
Ja, det stämmer, man måste hoppa över intronerna 
Det låter som ett bra sätt att testa, jag ska försöka senare om jag får en chans och låta dig veta… ju mer jag tänker på det, mRNA-sekvens=framåtriktad strängsekvens måste dock vara rätt…
Tack! 