[4] Jämförelse av förstärkt grönt fluorescerande protein och dess destabiliserade form som transkriptionsrapportörer

Detta kapitel beskriver användbarheten av grönt fluorescerande protein (GFP) som en reportergen i studier av genuttryck. GFP avger fluorescerande ljus vid excitation, utan tillsats av substrat eller kofaktor, både in vivo och in vitro. GFP-fluorescensaktiviteten kan detekteras med hjälp av ett fluorescensmikroskop, en fluorometer, en FACS-maskin (fluorescensaktiverad cellsortering) eller en avbildande mikroplattläsare. Enhanced GFP (EGFP) är en GFP-mutant med ljusare fluorescens som gör detektionen mycket känsligare. Användning av GFP som reportergen ger ett antal fördelar. Dessa inkluderar analys i realtid, minimal provhantering, möjlighet till analys av stora mängder och hög känslighet. GFP är dock ett stabilt protein, vilket innebär att det lätt ackumuleras när det uttrycks i celler. Ackumuleringen gör det inducerbara uttrycket av reportern okänsligt för varje förändring av induktionen och det skulle därför vara svårt att använda det i kinetikstudier. I det här kapitlet diskuteras användbarheten av EGFP och destabiliserad EGFP (dEGFP) som transkriptionsrapportörer genom att fusionera dem med NF-KB-bindande sekvens och thymicline kinase (TK)-promotor och jämföra skillnaden i uttryck mellan EGFP och dEGFP. Det diskuteras att både EGFP och dEGFP kan användas som rapportörer i transkriptionsstudier. Dessutom är dEGFP känsligare som svar på förändringar i behandling med tumörnekrosfaktor (TNF) på grund av dess snabbare omsättningshastighet.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.