Bakteriell samodling med översättare av cellsignaler och moduler för tillväxtreglering för autonomt reglerad kultursammansättning

AI-1-signalen kontrollerar cellens tillväxthastighet

Vi testade först E. coli:s kontroll av cellens tillväxthastighet genom transkriptionsreglering av ptsH, en gen som är involverad i sockertransport. HPr (som kodas av ptsH) är allmänt erkänd som ett av en serie proteiner (t.ex. E1, HPr, EII) som sekventiellt överför en fosforylgrupp från fosfenolpyruvat (PEP) till glukos (eller annan PTS-kolhydrat)34. HPr är mycket bevarad37. Vi upptäckte nyligen att HPr interagerar med AI-2-kinaset LsrK och påverkar AI-2-upptaget35. Vi utnyttjade den AI-2-modulerande funktionaliteten senare när vi konstruerade AI-2-sensorcellen. Här visade vi att ptsH-muterade stammar växer långsammare än vildtypstammar i minimala medier som innehåller glukos (kompletterande figur 1a). När ptsH placerades under en IPTG-inducerbar promotor i en ptsH-mutant kunde tillväxthastigheten kontrolleras baserat på IPTG-tillsats (kompletterande figur 1b). Viktigt är att vi visade att induktion av uttrycket av ptsH resulterar i en ökning av celltillväxthastigheten. Lika viktigt är att detta beteende är oberoende av om medierna innehåller glukos som huvudsaklig kolkälla eller inte (kompletterande figur 1c).

Baserat på detta konceptbevis konstruerade vi härnäst QS-signalstyrd tillväxthastighet. För att konstruera den kontrollerande stammen placerades ptsH under kontroll av AI-1 lasI QS-promotorn på plasmidet pAHL-HPr (fig. 2a) i en ptsH-muterad stam PH04. På andra ställen på plasmidet uttrycktes både dsRedExpress2, för cellvisualisering, och LasR, som krävs för aktivering av lasI-promotorn, under en konstitutiv T5-promotor. Tillsats av AI-1 till den kontrollerande stammen ökade celltillväxthastigheten upp till 1,8 gånger den grundläggande tillväxthastigheten på ett dosberoende sätt (fig. 2b). Den uppmätta specifika tillväxthastigheten (mellan 1 och 4 timmar efter tillsats av AI-1) tjänade som grund för en modell av tillväxthastighet av Monod-typ baserad på AI-1-nivån (fig. 2c).

AI-1 modulerar sammansättningen i samkulturer av controller-celler

De AI-1-reglerade controller-cellerna samodlades sedan med andra stammar för att verifiera att tillsats av AI-1 förändrade samkulturens sammansättning. Tillväxtregulatorceller som uttrycker ett rött fluorescerande protein (PH04 pAHL-ptsH) samkulturerades med antingen PH04 pCT6 eller TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 har en liknande grundtillväxt som PH04 pAHL-ptsH, medan TOP10 pT5G växer betydligt snabbare. Kulturerna inokulerades vid ungefär samma celltäthet och kompletterades med varierande AI-1-nivåer. Efter 8 timmar togs prover för analys med hjälp av fluorescensmikroskopi och kvantifierades med hjälp av ImageJ. Som förväntat, när controllerceller odlades med PH04, ökade kultursammansättningen av controllercellerna med ökande AI-1-koncentration (fig. 3a). En liknande trend sågs när cellerna odlades med TOP10, trots den snabbare tillväxthastigheten hos TOP10 (fig. 3b). Det vill säga, i samodlingar utan AI-1 sjönk fraktionen av kontrollerande celler i TOP10-samodlingarna faktiskt betydligt från de ursprungliga ~0,5 till ~0,09 under de efterföljande 8 timmarna. Tillsats av AI-1 motverkade denna skillnad i tillväxthastighet och resulterade i en högre nivå av kontrollerande celler under samma 8-timmarsperiod. Dessa resultat visar att AI-1 (som inte är en E. coli QS-signalmolekyl), oavsett andra stammar i kulturen och deras respektive tillväxthastighet, modulerar tillväxthastigheten hos den konstruerade kontrollantstammen, och förändringen skedde tillräckligt snabbt för att möjliggöra en observerbar förändring av kulturens sammansättning, särskilt även under relativt kortvariga batchförhållanden (i motsats till matade batch-, upprepade batch- eller kontinuerliga kulturer).

Nästan samodlades den AI-1-reglerade kontrollantstammen i samodling med celler som producerar AI-1 när den induceras. PH04 pSox-LasI och PH04 pAHL-HPr samodlades i samodling tillsammans. Plasmid pSox-LasI innehåller lasI, som syntetiserar AI-1, under den pyocyanininducerbara soxS-promotorn7. I det här experimentet får kontrollstammen en signal från en översättarstam som i sin tur producerar AI-1 som svar på pyocyanin. På detta sätt visas att kontrollsystemet för samodlingskulturer reagerar på en särskild molekylär signal. Här inokulerades varje kultur med ungefär samma starttäthet och samkulturerna utsattes antingen för pyocyanin eller inte. Exponerade kulturer visade ökad produktion av AI-1 och motsvarande ökad sammansättning av PH04 pAHL-HPr inom 5 timmar (fig. 3c). Dessa resultat visar att AI-1 som produceras från en alternativ stam kan modulera tillväxthastigheten hos den styrande stammen, och att detta kan ske på de tidsskalor som krävs för att påverka förändringar i en batchprocess. Dessutom visar detta på den potentiella genomförbarheten av en användarreglerad samodling baserad på en användarspecifik tillämpning av en molekyl eller inducerare, i detta fall pyocyanin. Därefter konstruerade vi översättarstammen för att skapa en autonomt reglerad samkultur baserad på den genomgående AI-2-signalmolekylen.

Design av AI-2-sensorerande översättarceller

För att konstruera cellinjer som känner av AI-2 och producerar AI-1 konstruerade vi stammar för att aktivera uttrycket av LasI, som syntetiserar AI-1, när AI-2 lsr-promotorn aktiveras. Vi använde ett system med två plasmider för att förstärka uttrycket från den svaga lsr-promotorn25 (fig. 4a). I korthet fosforyleras AI-2 av LsrK och fosforylerat AI-2 lindrar repressionen av promotorn av LsrR, vilket ökar transkriptionen av lsr-transportergenerna och påskyndar upptaget av AI-2. Samtidigt resulterar AI-2-medierad aktivering av lsr-promotorn i transkription av T7 RNA-polymeras från plasmid pCT6 och efterföljande transkription av lasI från plasmid pET-LasI.

Systemet konstruerades först i E. coli-värdstammen CT104, som är en luxS-mutant (t.ex. oförmögen att producera AI-2). CT104 saknar också lsrFG, som ansvarar för nedbrytning av den fosforylerade AI-2-signalen, vilket ökar cellens känslighet för AI-238. Vi verifierade att denna cellinje, CT104 pCT6 pET-LasI, producerade AI-1 när den odlades i konditionerat media (CM) från AI-2 producerande BL21 (kompletterande figur 2). BL21 odlades till olika celltätheter, CM samlades upp och CT104-celler odlades i det samlade CM. Det är viktigt att AI-1 som producerades av CT104-cellerna korrelerade med tätheten hos de AI-2 producerande BL21-cellerna (kompletterande figur 2a). Vi testade också om translatorceller som tillsattes till konsortier med varierande fraktioner av AI-2 producerande celler kunde producera AI-1-signalen baserat på konsortiets sammansättning. CT104-celler tillsattes till kulturer med varierande proportioner av BL21 (luxS+) till BL21 ΔluxS. Efter 6 timmar var nivån på AI-1-signalen i de extracellulära medierna en indikation på kulturens sammansättning, som i sin tur främst baseras på den ursprungliga fraktionen av luxS+-celler25 (kompletterande figur 2b).

Ovanstående experiment visade att en cellinje kunde konstrueras för att producera AI-1 som svar på AI-2 från AI-2-producerande celler. Dessa experiment utfördes i LB-medier och inte i medier med glukos. Närvaron av glukos hämmar upptaget av AI-2 och aktiviteten hos lsr-promotorn39 och användningen av CT104-cellerna skulle eventuellt kunna begränsas till medier utan glukos (se kompletterande figur 3 för schemat för AI-2 QS-banan). Baserat på kunskapen om AI-2 QS-systemet försökte vi konstruera en stam som kunde ta upp AI-2 och aktivera lsr-promotorn i glukosinnehållande medier. På detta sätt skulle våra resultat kunna tillämpas mer generellt. Tidigare har vi visat att HPr (som kodas av ptsH) interagerar med LsrK och hämmar LsrK-kinasaktiviteten, och att ptsH-mutanter har visat sig kunna ta upp AI-2 även i medier som innehåller glukos35. Vi antog därför att användning av PH04 (ΔptsH ΔluxS) som värdstam skulle möjliggöra AI-2-baserad produktion av AI-1 i medier som innehåller glukos. Vi testade translatorcellerna med hjälp av båda värdstammarna i LB- och M9-glukosmedier med och utan AI-2. Nivån av AI-1 som producerades var beroende av tillsatsen av AI-2, men också av värdstammen och medierna (fig. 4b). Båda stammarna producerade AI-1 när cellerna tillsattes till LB-medier med AI-2. Som förväntat resulterade användningen av värdstammen CT104 i M9-medier i en liten eller obetydlig vikförändring av AI-1-aktiviteten när man jämförde kulturer med och utan AI-2. Viktigt är att PH04-överföringscellerna dock visade AI-2 aktiverad produktion av AI-1 i M9 + glukosmedia. På så sätt skulle det konstruerade systemet kunna användas i glukosinnehållande medier.

Karakterisering av PH04 translatorceller

PH04 translatorceller tar upp AI-2 signalmolekylen, transducerar signalen genom att aktivera uttrycket av LasI och syntetiserar och utsöndrar AI-1. Den önskade AI-1-utgången är sedan en funktion av AI-2-ingången. Vi har karakteriserat AI-2-signalerad produktion av AI-1 i PH04-translatorstammen över tid och för en rad biologiskt relevanta AI-2-koncentrationer. Hastigheten för AI-1-produktion av PH04 translatorceller visade sig vara dosberoende av AI-2 (fig. 5a). Vi noterar att under dessa och liknande förhållanden förbrukas AI-2 till största delen inom 4 timmar (fig. 5b). Tillsats av AI-2 eller AI-2-baserad produktion av AI-1 i dessa batchkulturer resulterade inte i någon observerbar minskning av celltillväxten (fig. 5c). Vi karakteriserade sedan hastigheten för AI-1-produktion per cell över tiden för varje testad AI-2-koncentration genom att plotta en logistisk funktion genom AI-1-data, bestämma derivatan av denna ekvation över tiden och dividera derivatan med celltätheten över tiden (kompletterande tabell 1), vilket ger en tidsberoende specifik produktionshastighet. De resulterande diagrammen (fig. 5d) visar den uppskattade AI-1-produktionstakten per cell som en funktion av tillsatt AI-2 och tiden från tillsättningen av AI-2. Som kommer att visas senare stämmer detta överens med en underliggande observation som vi har observerat, nämligen att banan för genuttryck som svar på en initial cue är ganska robust21,38,40.

Nästan testades effekten av AI-1 som produceras av PH04-översättarcellerna på tillväxthastigheten hos de AI-1-responsiva controller-cellerna. Det vill säga, tillväxtkänsliga celler tillsattes till CM som innehöll AI-1 från translatorceller som hade exponerats för varierande nivåer av AI-2 och odlades i ~3 timmar (kompletterande figur 4a). Utöver vad som visades i fig. 5 där AI-1 genereras från direkt exponering för AI-2, visar detta experiment att cellöversättningen av AI-2 till AI-1 kan göras med det nödvändiga uttrycket och den nödvändiga cellodlingsdynamiken för att påverka tillväxthastigheten hos den andra populationen (kompletterande fig. 4b). Vi noterar också att den dynamiska tillväxthastigheten hos controller-cellerna visade sig minska i tid under de efterföljande 3 timmarna. Denna observation blev mer dramatisk i senare samodlingsförsök.

Autonom reglering av samodlingssammansättningen

Nästan tillsatte vi översättarcellerna (kallad population A) och de AI-1-responsiva controller-cellerna (population B) till lösningar som hade en rad olika initiala AI-2-koncentrationer. I samkulturer av översättarceller och kontrollerande celler reglerar översättarcellerna självständigt konsortiets sammansättning baserat på den initiala AI-2 nivån. I den kompletterande fig. 5 resulterade samkulturer med ökade initiala AI-2 nivåer i en ökning av AI-1 (kompletterande fig. 5b) och en motsvarande ökning av den relativa förekomsten av population B (kompletterande fig. 5a). Dessa resultat visade på konceptet med signalmedierad autonom kontroll av konsortiepopulationen. Viktigt är att uppskattningar av tillväxthastigheten för population A och population B stämde överens med förväntade värden för tillväxthastigheten som uppmättes under monokulturexperiment (kompletterande fig. 5c).

Därefter, efter att ha visat att översättarcellerna kunde reglera konsortiens sammansättning baserat på exponering för AI-2, utvecklade vi en matematisk modell för att karakterisera systemdynamiken. På detta sätt kan man förutsäga samkulturens beteende givet specifika utgångsförhållanden, utformning av tillväxthastighet osv. för att bestämma de parametrar som krävs för att rikta in sig på ett önskat resultat. Denna konceptuellt enkla matematiska modell skapades för att förutsäga samkulturens beteende med hjälp av data från de enskilda stammarna. Modellen består av fyra vanliga differentialekvationer, en för varje populationstäthet, substratkoncentration och AI-1-koncentration (kompletterande tabeller 2 och 3). Monod-tillväxtkinetik med en konstant avkastningskoefficient användes för att modellera celltillväxt och substratkoncentration, med ytterligare funktioner som redovisar produktion och/eller effekter av QS-molekylerna. Den AI-1 som produceras av population A baseras både på nivån av AI-2-exponering och tiden (fAI1). I det tidigare arbetet38 fann vi att tidsberoende banor i cellbeteendet var en följd av den initiala exponeringen för autoinducerare så att tidsberoende funktioner för AI-1-produktionen skulle vara rimliga här. Tillväxthastigheten för population B formulerades utifrån den rådande nivån av AI-1 (fHPr). Maximal specifik tillväxthastighet mättes med hjälp av experimentella data, avkastningen uppskattades utifrån experimentellt observerad densitet i stationär fas och kända initiala substratkoncentrationer, och K1- och K2-värden valdes utifrån litteraturvärden för glukos. MATLAB (version R2016a) ode45-lösaren användes för att lösa ODE-systemet. Modellen kan användas för att visa hur en samodlingspopulation förutspås förändras med tiden med tanke på dessa enkla fenomenologiska hastighetsekvationer och bäst passande konstanter. Som nämnts ger detta en grund för att avgöra om en samkultur ens kan förutsägas utvecklas under de begränsade tider som finns tillgängliga i en batchkultur. Viktigt är att våra resultat från monokulturer används för att simulera experimentella resultat från samkulturer.

Detta innebär att vi härnäst utvärderade autonomt programmerad samkulturkontroll via modellförutsägelser. Samkulturer av populationerna A och B placerades tillsammans för en rad initiala cellpopulationer och lades sedan till medier med föreskrivna nivåer av AI-2 för att sätta igång en populationsbana. I vårt system väljs den initiala sammansättningen utifrån förhållandet mellan de celler som tillförs i samkulturen och sedan justeras kulturens sammansättning autonomt över tiden utifrån AI-2nivån i medierna. Vi jämförde resultaten med vår modell. I figur 6 visas samkulturens sammansättning och AI-1-nivån efter 5 timmar för en rad olika förhållanden, inklusive varierande inledande A:B-förhållanden och AI-2-nivåer. I dessa tester använde vi en initial population celltäthet. Viktigt är att vi fann att vår modell väl förutsade de experimentella resultaten av både AI-1-nivån och samkulturens sammansättning. Vi noterar också att modellen kan användas för att välja initiala förhållanden som ger ett önskat resultat. För att till exempel sikta på en population B med en relativ celltäthet på 55 % vid 5 timmar kan samkulturen startas med ett initialt A:B-förhållande på 60:40 och en AI-2-koncentration på 40 µM. Andra scenarier testades och validerades, enligt bilden. Dessa resultat visar tydligt att det initiala tillståndet för cellsammansättningen (t.ex. förhållandet A:B) och exponeringen för olika nivåer av AI-2 båda påverkar samodlingspopulationens utveckling. Lika viktigt är dock att den ortogonala signalmolekylen, AI-1, uppförde sig enligt modellen. Vi förväntar oss att i förlängningen kommer inkluderandet av denna och andra översättarsignaler att göra det möjligt att utforma och/eller kontrollera ytterligare, varierade eller mer komplicerade konsortier.

Det vill säga, vi testade samodlingsregleringssystemet genom att exponera det för en AI-2-koncentration, 80 µM, som var högre än de AI-2-koncentrationer som användes för att karakterisera översättarcellerna, och som vi inte hade någon modell för. Vi använde resultaten från samkulturen (fig. 6) för att uppskatta beteendet hos translatorceller i en monokultur vid denna AI-2-koncentration. Vi utförde sedan monokulturförsök genom att tillsätta 80 µM AI-2 till translatorcellerna och visade att vi kunde förutsäga monokulturbeteendet med hjälp av data från samodlingen och modellen. I kompletterande figur 6a visas hastigheten för AI-1-produktion som förutspåddes från samodlingsdata och modellen (linje) och den faktiska hastigheten för AI-1-produktion under monokulturexperimentet (datapunkter). Kompletterande figur 6b visar de förutspådda AI-1-nivåerna i monokulturen över tiden jämfört med de faktiska uppmätta AI-1-nivåerna. Den förutspådda AI-1-nivån bestämdes med hjälp av modellen genom att den uppskattade AI-1-produktionshastigheten och den initiala celltätheten i monokulturen matades in.

Sist testade vi vårt samodlingssystem under en längre tidsperiod genom att använda upprepad satsmatning med flera AI-2-tillsatser (fig. 7). Här var vårt mål att utöka populationsbanan utöver den som erhålls genom att variera den initiala sammansättningen och exponeringen för en fast AI-2 nivå i en enkel batchkultur. På detta sätt testade vi styrsystemets robusthet. I fig. 6 till exempel, för kulturer som inledningsvis hade ~40 % population B, fann vi att vi endast kunde uppnå nivåer av population B som närmade sig 60 % och endast genom exponering för höga nivåer (>80 μM) av AI-2. Genom att testa ett upprepat batchsystem trodde vi att vi kunde driva populationen B till över 80 % genom att helt enkelt sätta tillbaka och förlänga systemet i tiden. Vi tillsatte vår samkultur till medier med varierande nivåer av AI-2 och var 3:e timme återuppsattes cellerna i nya medier med ytterligare AI-2. Omedelbart före varje resuspension togs prover för analys av AI-1-koncentrationen och cellkulturens sammansättning (fig. 7a, b). Celltäthet och AI-2-aktivitet mättes också (kompletterande figur 7). Vi fann att i denna mer komplexa experimentella uppställning fungerade systemet i allmänhet som planerat. Vi fann att vi genom att exponera mindre mängder AI-2 (20 och 40 μM) kunde nå nästan 80 % population B. Under detta test fann vi dock att våra experimentella resultat avvek från de resultat som förutspåddes av vår matematiska modell. Vi tittade närmare på den AI-1 som producerades och kulturernas tillväxthastighet under varje segment på 3 timmar för att få en förståelse för kulturdynamiken utifrån den observerade avvikelsen från den enkla modellen. Till exempel var den AI-1 som producerades under den andra och tredje tretimmarscykeln högre än vad som förutspåddes av modellen. I efterhand var detta logiskt eftersom cellerna efter den första batchcykeln redan hade producerat LasI (som syntetiserar AI-1), och den extra AI-2 inducerade sannolikt ytterligare produktion av LasI (vi inkluderade ingen nedbrytningsmärkning på LasI, så dess underhåll borde ha förutsetts). Vi justerade sedan modellen så att AI-1-produktionshastigheten i början av varje efterföljande resuspension i nya medier var densamma som i slutet av den föregående cykeln (fig. 7c, heldragna linjer). Införandet av dessa nya funktioner för AI-1-produktion i modellen resulterade i värden för AI-1 som stämde väl överens med de experimentella AI-1-data (fig. 7a, modellen i heldragna linjer). På samma sätt uppskattade vi tillväxthastigheten hos controllercellerna (se kompletterande anmärkning 1) och fann att tillväxthastigheten i kombination med AI-1-koncentrationerna inte passade vår tidigare fAI1-funktion (fig. 7d). Vi noterar att vi för att beräkna tillväxthastigheten hos controllercellerna antog att tillväxthastigheten hos translatorcellerna förblev konstant, även om de kan ha minskat något till följd av upprepade AI-2-tillsatser. Tillväxthastigheten hos kontrollanten tycktes till en början öka som en funktion av AI-1, men vid efterföljande omspädning i färska medier minskade den totala tillväxthastigheten. Vi hade tidigare noterat en dynamisk minskning av tillväxthastigheten vid överuttryck av HPr och LasI (kompletterande figurer 4 och 5). Här misstänker vi att antingen en metabolisk börda som läggs på cellerna från upprepad exponering för höga nivåer av AI-1 eller minskade substrat- eller näringsnivåer kan ha varit orsaker till minskad tillväxt under de senare cyklerna. Viktigt är att vi genom att justera vår modell så att effekten av AI-1 på tillväxthastigheten minskade med tiden (se kompletterande anmärkning 2) kunde anpassa våra experimentella data (fig. 7b, justerad modell i heldragna linjer) utan att lägga till modellkomplexitet.

Sammanfattningsvis reagerade vårt samodlingssystem som avsett oavsett om det placerades i medier utan AI-2 eller med en hög nivå av AI-2. Dessutom visade våra resultat kontrollerbara populationstätheter som sträckte sig från 40 till 80 % av de styrande cellerna. Dessutom gav en jämförelse med vår ursprungliga modell en inblick i hur systemet betedde sig i denna mer komplexa experimentella uppställning; översättarcellerna tycktes producera högre nivåer av AI-1 över tiden medan controller-cellerna tycktes ha minskade AI-1-reglerade förändringar i tillväxthastighet över tiden.

För det sista kan modellen ge en grund för att utforska in silico hur de strategier som används här för autonomt reglerade kulturer (som kännetecknas av signalreglerad tillväxthastighet och inhemsk cell-cell-signalering) skulle kunna utvidgas till andra system, inklusive användarreglerade eller programmerbara system som skulle kunna styras dynamiskt. Kemostatkulturer skiljer sig till exempel från det nuvarande autonoma systemet genom att deras utdata styrs av användarspecificerade indata, t.ex. utspädningshastigheten. Som ett första steg utförde vi simuleringar av kemostatodlade samkulturer genom att lägga till standardflödestermerna i batchmodellen (kompletterande figur 8, kompletterande tabeller 4 och 5). I vissa fall fann vi att utspädningshastigheten definierar en kulturkomposition i stationärt tillstånd som i sin tur senare kan ”trimmas” inom ett intervall som begränsas av utspädningshastigheten. ”Inställningen” kan uppnås genom extern modulering av cell-cell-signalering, t.ex. genom exogen tillsats av signalmolekyler. Dessa fall illustrerar hur samspelet mellan vårt autonoma system och andra användarstyrda system kan leda till mer komplexa populationsbanor. Våra simuleringsresultat här tjänar som en konceptuell ram för kontroll av konsortiers sammansättning i mer komplexa, användarstyrda system. Ytterligare diskussioner om kemostatsimuleringarna finns i kompletterande anmärkning 3.