Oplysning av processen för prokaryotisk transkription och översättning
Prokaryoter, som inkluderar bakterier och arkéer, är mestadels encelliga organismer som per definition saknar membranbundna kärnor och andra organeller. En bakteriekromosom är en kovalent sluten cirkel som till skillnad från eukaryota kromosomer inte är organiserad kring histonproteiner. Den centrala delen av cellen där prokaryotiskt DNA befinner sig kallas nukleoid. Dessutom har prokaryoter ofta rikligt med plasmider, som är kortare cirkulära DNA-molekyler som kanske bara innehåller en eller ett fåtal gener. Plasmider kan överföras oberoende av bakteriekromosomen under celldelningen och bär ofta på egenskaper som t.ex. antibiotikaresistens. På grund av dessa unika egenskaper skiljer sig transkription och genreglering något mellan prokaryota celler och eukaryota celler.
Lärandemål
- Förstå de grundläggande stegen i transkriptionen av DNA till RNA i prokaryota celler
- Förstå grunderna i prokaryota translation. och hur den skiljer sig från eukaryotisk translation
Prokaryotisk transkription
Initiering av transkription i prokaryoter
Prokaryoter har inte membran-omslutna kärnor. Därför kan processerna transkription, översättning och nedbrytning av mRNA ske samtidigt. Den intracellulära nivån av ett bakterieprotein kan snabbt förstärkas genom att flera transkriptions- och translationshändelser sker samtidigt på samma DNA-mall. Prokaryotisk transkription omfattar ofta mer än en gen och producerar polycistroniska mRNA som specificerar mer än ett protein.
Vår diskussion här kommer att exemplifiera transkription genom att beskriva denna process i Escherichia coli, en välstuderad bakterieart. Även om det finns vissa skillnader mellan transkriptionen i E. coli och transkriptionen i arkéer kan en förståelse av E. coli-transkriptionen tillämpas på praktiskt taget alla bakteriearter.
Prokaryotiskt RNA-polymeras
Prokaryoter använder samma RNA-polymeras för att transkribera alla sina gener. I E. coli består polymeraset av fem polypeptidunderenheter, varav två är identiska. Fyra av dessa underenheter, som betecknas α, α, β och β′ utgör polymerasets kärnenzym. Dessa subenheter samlas varje gång en gen transkriberas, och de demonteras när transkriptionen är avslutad. Varje underenhet har en unik roll; de två α-subenheterna är nödvändiga för att samla polymeraset på DNA, β-subenheten binder till ribonukleosidtrifosfatet som kommer att bli en del av den framväxande ”nyfödda” mRNA-molekylen, och β′ binder till DNA-mallsträngen. Den femte underenheten, σ, är endast involverad i transkriptionsinitieringen. Den ger transkriptionsspecificitet så att polymeraset börjar syntetisera mRNA från en lämplig initieringsplats. Utan σ skulle kärnenzymet transkribera från slumpmässiga platser och producera mRNA-molekyler som specificerade proteingibberish. Polymeraset som består av alla fem subenheter kallas holoenzym (ett holoenzym är en biokemiskt aktiv förening som består av ett enzym och dess koenzym).
Prokaryotiska promotorer
Figur 1. σ-underenheten av prokaryotiskt RNA-polymeras känner igen konsensussekvenser som finns i promotorregionen uppströms transkriptionens startsikte. σ-underenheten dissocieras från polymeraset efter att transkriptionen har påbörjats.
En promotor är en DNA-sekvens på vilken transkriptionsmaskineriet binder sig och påbörjar transkriptionen. I de flesta fall finns promotorer uppströms de gener som de reglerar. Den specifika sekvensen hos en promotor är mycket viktig eftersom den avgör om motsvarande gen transkriberas hela tiden, ibland eller sällan. Även om promotorer varierar mellan prokaryotagenomerna finns det några få element som är bevarade. I regionerna -10 och -35 uppströms från initieringsstället finns det två konsensussekvenser för promotorn, eller regioner som är likartade i alla promotorer och i olika bakteriearter (figur 1).
Den konsensussekvens för -10, som kallas -10-regionen, är TATAAT. Sekvensen -35, TTGACA, känns igen och binds av σ. När denna interaktion väl är gjord binder kärnenzymets subenheter till platsen. Den A-T-rika -10-regionen underlättar avvecklingen av DNA-mallen, och flera fosfodiesterbindningar bildas. Transkriptionsinitieringsfasen avslutas med produktion av abortiva transkript, som är polymerer av cirka 10 nukleotider som tillverkas och frigörs.
Längdsättning och terminering i prokaryoter
Transkriptionens förlängningsfas inleds med frigörandet av σ-underenheten från polymeraset. Dissocieringen av σ gör det möjligt för kärnenzymet att fortsätta längs DNA-mallen och syntetisera mRNA i 5′ till 3′-riktningen med en hastighet av cirka 40 nukleotider per sekund. När förlängningen fortskrider rullas DNA:t kontinuerligt av framför kärnenzymet och återigen upp bakom det (figur 2). Basparningen mellan DNA och RNA är inte tillräckligt stabil för att upprätthålla stabiliteten hos komponenterna i mRNA-syntesen. I stället fungerar RNA-polymeraset som en stabil länk mellan DNA-mallen och de framväxande RNA-strängarna för att se till att elongationen inte avbryts i förtid.
Figur 2. Klicka för en större bild. Under elongationen spårar det prokaryotiska RNA-polymeraset längs DNA-mallen, syntetiserar mRNA i 5′ till 3′-riktningen och av- och påspolar DNA:t allteftersom det läses.
Prokaryotiska termineringssignaler
När en gen har transkriberats måste det prokaryotiska polymeraset instrueras att dissociera sig från DNA-mallen och frigöra det nygjorda mRNA:t. Beroende på vilken gen som transkriberas finns det två typer av termineringssignaler. Den ena är proteinbaserad och den andra är RNA-baserad. Rho-beroende terminering styrs av rho-proteinet, som följer med bakom polymeraset på den växande mRNA-kedjan. Nära slutet av genen stöter polymeraset på en löpning av G-nukleotider på DNA-mallen och det stannar upp. Som ett resultat av detta kolliderar rho-proteinet med polymeraset. Interaktionen med rho frigör mRNA från transkriptionsbubblan.
Rho-oberoende terminering styrs av specifika sekvenser i DNA-mallsträngen. När polymeraset närmar sig slutet av den gen som transkriberas möter det en region som är rik på C-G-nukleotider. Det mRNA viker sig tillbaka på sig självt och de komplementära C-G-nukleotiderna binds samman. Resultatet är en stabil hårnål som gör att polymeraset stannar upp så snart det börjar transkribera ett område som är rikt på A-T-nukleotider. Den komplementära U-A-regionen i mRNA-transkriptet bildar endast ett svagt samspel med mall-DNA:et. Detta, tillsammans med det avstannade polymeraset, inducerar tillräcklig instabilitet för att kärnenzymet ska bryta sig loss och frigöra det nya mRNA-transkriptet.
När transkriptionen avslutas är transkriptionsprocessen avslutad. När termineringen sker skulle det prokaryotiska transkriptet redan ha använts för att påbörja syntesen av många kopior av det kodade proteinet eftersom dessa processer kan ske samtidigt. Föreningen av transkription, översättning och till och med nedbrytning av mRNA är möjlig eftersom alla dessa processer sker i samma 5′- till 3′-riktning och eftersom det inte finns någon membranmässig uppdelning i den prokaryotiska cellen (figur 3). Närvaron av en kärna i eukaryota celler utesluter däremot samtidig transkription och översättning.
Figur 3. Flera polymeraser kan transkribera en enda bakteriell gen medan många ribosomer samtidigt översätter mRNA-transkriptionerna till polypeptider. På detta sätt kan ett specifikt protein snabbt nå en hög koncentration i bakteriecellen.
Besök denna BioStudio-animation för att se processen för prokaryotisk transkription.
Praktikfrågor
Vilken subenhet av E.
- α
- β
- β′
- σ
De -10 och -35 regionerna i prokaryotiska promotorer kallas konsensussekvenser eftersom ________.
- De är identiska i alla bakteriearter
- De liknar varandra i alla bakteriearter
- De finns i alla organismer
- De har samma funktion i alla organismer
Prokaryotisk översättning
Translationen är likartad hos prokaryoter och eukaryoter. Här kommer vi att undersöka hur translation sker i E. coli, en representativ prokaryot, och specificera eventuella skillnader mellan bakteriell och eukaryotisk translation.
Initiering
Initieringen av proteinsyntesen börjar med bildandet av ett initieringskomplex. I E. coli innefattar detta komplex den lilla 30S-ribosomen, mRNA-mallen, tre initieringsfaktorer som hjälper ribosomen att samlas korrekt, guanosintrifosfat (GTP) som fungerar som energikälla och ett särskilt initierings-tRNA som bär på N-formylmetionin (fMet-tRNAfMet) (figur 4). Initiator-tRNA:t interagerar med startkodonet AUG i mRNA:t och bär på ett formylerat metionin (fMet). På grund av dess inblandning i initieringen infogas fMet i början (N-terminus) av varje polypeptidkedja som syntetiseras av E. coli. I E. coli mRNA finns en ledarsekvens uppströms det första AUG-kodonet, kallad Shine-Dalgarno-sekvensen (även känd som den ribosomala bindningsplatsen AGGAGAGG), som genom komplementär basparning interagerar med de rRNA-molekyler som utgör ribosomen. Denna interaktion förankrar den ribosomala 30S-underenheten på rätt plats på mRNA-mallen. Vid denna punkt binder sedan den 50S ribosomala underenheten till initieringskomplexet och bildar en intakt ribosom.
I eukaryoter är initieringskomplexbildningen likartad, med följande skillnader:
- Det initierande tRNA:t är ett annat specialiserat tRNA som bär på metionin, kallat Met-tRNAi
- Istället för att binda till mRNA:t vid Shine-Dalgarno sekvensen känner det eukaryotiska initieringskomplexet igen 5′-huvudet på det eukaryotiska mRNA:t, och springer sedan längs med mRNA:t i 5′- till 3′-riktningen tills AUG-startkodonet känns igen. Vid denna tidpunkt binder 60S-underenheten till komplexet av Met-tRNAi, mRNA och 40S-underenheten.
Figur 4. Translation i bakterier börjar med bildandet av initieringskomplexet, som omfattar den lilla ribosomala underenheten, mRNA:t, initiator-tRNA:t som bär N-formyl-methionin och initieringsfaktorer. Därefter binder 50S-underenheten och bildar en intakt ribosom.
Förlängning
I prokaryoter och eukaryoter är grunderna för förlängning av översättning desamma. I E. coli bildar bindningen av den 50S ribosomala underenheten för att producera den intakta ribosomen tre funktionellt viktiga ribosomala platser: A (aminoacyl)-platsen binder inkommande laddade aminoacyl-tRNA:er. P-platsen (peptidyl) binder laddade tRNA som bär aminosyror som har bildat peptidbindningar med den växande polypeptidkedjan men som ännu inte har separerats från motsvarande tRNA. E (exit)-platsen frigör dissocierade tRNA:er så att de kan laddas med fria aminosyror. Det finns ett anmärkningsvärt undantag från denna monteringslinje av tRNA:er: Under initieringskomplexbildningen går bakteriellt fMet-tRNAfMet eller eukaryotiskt Met-tRNAi in i P-platsen direkt utan att först gå in i A-platsen, vilket ger en fri A-plats som är redo att ta emot det tRNA som motsvarar det första kodonet efter AUG.
Förlängningen fortsätter med enskilda kodonförflyttningar av ribosomen, som var och en kallas för en translokationshändelse. Under varje translokationshändelse kommer de laddade tRNA:erna in på A-platsen, förflyttas sedan till P-platsen och slutligen till E-platsen för avlägsnande. Ribosomala rörelser, eller steg, induceras av konformationsförändringar som förflyttar ribosomen med tre baser i 3′-riktningen. Peptidbindningar bildas mellan aminogruppen i den aminosyra som är knuten till A-site tRNA och karboxylgruppen i den aminosyra som är knuten till P-site tRNA. Bildandet av varje peptidbindning katalyseras av peptidyltransferas, ett RNA-baserat ribozym som är integrerat i den ribosomala 50S-underenheten. Den aminosyra som är bunden till P-site tRNA är också bunden till den växande polypeptidkedjan. När ribosomen tar ett steg över mRNA:t går det tidigare P-site tRNA:t in i E-site, lossnar från aminosyran och stöts ut. Flera av stegen under förlängningen, inklusive bindning av ett laddat aminoacyltRNA till A-platsen och translokation, kräver energi från GTP-hydrolys, som katalyseras av specifika förlängningsfaktorer. Otroligt nog tar översättningsapparaten i E. coli endast 0,05 sekunder för att lägga till varje aminosyra, vilket innebär att ett protein med 200 aminosyror kan översättas på endast 10 sekunder.
Terminering
Termineringen av översättningen inträffar när man stöter på ett nonsense-kodon (UAA, UAG eller UGA) för vilket det inte finns något komplementärt tRNA. När de anpassar sig till A-sidan känns dessa nonsense-kodoner igen av frisättningsfaktorer i prokaryoter och eukaryoter som resulterar i att aminosyran på P-sidan lossnar från sitt tRNA, vilket frigör den nybildade polypeptiden. De små och stora ribosomala underenheterna dissocieras från mRNA:t och från varandra; de rekryteras nästan omedelbart till ett annat översättningsinit iationskomplex.
Sammanfattningsvis finns det flera viktiga egenskaper som skiljer prokaryotiskt genuttryck från det som ses i eukaryoter. Dessa illustreras i figur 5 och listas i tabell 1.
Figur 5. (a) Hos prokaryoter sker processerna transkription och translation samtidigt i cytoplasman, vilket möjliggör en snabb cellulär reaktion på en miljöindikation. (b) Hos eukaryoter är transkriptionen lokaliserad till kärnan och translationen lokaliserad till cytoplasman, vilket separerar dessa processer och kräver RNA-bearbetning för stabilitet.
Tabell 1. Jämförelse av översättning i bakterier kontra eukaryoter | ||
---|---|---|
Egenskaper | Bakterier | Eukaryoter |
Ribosomer | 70S
|
80S
|
Aminosyra som bärs av initiator tRNA | fMet | Met |
Shine-Dalgarnosekvens i mRNA | Närvarande | Nej |
Simultan transkription och översättning | Ja | Nej |
Kontrollera din förståelse
Svara på frågan/frågorna nedan för att se hur väl du förstår de ämnen som behandlades i föregående avsnitt. Den här korta frågesporten räknas inte in i ditt betyg i kursen och du kan göra om den ett obegränsat antal gånger.
Använd den här frågesporten för att kontrollera din förståelse och besluta om du ska (1) studera det föregående avsnittet ytterligare eller (2) gå vidare till nästa avsnitt.