Cystintransport och cystinosin
Cystin ackumuleras i lysosomer i cystinotiska leukocyter14 och fibroblaster.44 Klorokin och andra hämmare av lysosomal proteinnedbrytning dämpar återackumuleringen av cystin i utarmade cystinotiska celler, vilket tyder på att intracellulär proteinnedbrytning är källan till det överflödiga cystinet45 . Cystininnehållet i normala och cystinotiska celler kan också ökas genom belastning med cystindimetylester46 eller cystein-glutathionblandad disulfid44. Det är dock anmärkningsvärt att utgången av cystin från lysosomer är märkbart nedsatt i cystinbelastade cystinotiska celler.44,46 Cystinutflödet från celler som härstammar från heterozygota bärare av den nefropatiska cystinosisgenen är inte signifikant nedsatt jämfört med celler av vildtyp44 . Mätning av cystin-cystin mottransport i lysosomala granuler visar dock tydligt på en avsaknad hos homozygota patienter, med värden för heterozygota bärare som är ungefär hälften så stora som hos normala kontrollceller47; defekt lysosomal cystintransport är således den orsakande defekten vid cystinosis.
Den biokemiska diagnosen av både patienter48 och heterozygota bärare49 var kritisk för den fina kartläggningen av cystinosisgenen på kromosom 17p13. Ett viktigt genombrott var upptäckten av genomiska deletioner för en länkad mikrosatellitmarkör, följt av identifieringen av CTNS-genen inom det minsta deletionsintervallet.50 CTNS-genen består av 12 exoner och kodar för ett protein med 367 aminosyror som kallas cystinosin. Cystinosin består av sju transmembrandomäner, en 128-aminosyra N-terminus som innehåller sju glykosyleringsställen och en 10-aminosyra cytosolisk C-terminus. Alla patienter med de olika subtyperna av cystinosis verkar ha en mutation i CTNS-genen (dvs. det finns hittills inga bevis för genetisk heterogenitet). Den vanligaste mutationen är en 57-kb-deletion som flyttar 5′-regionen uppströms från exon 1051,52. Över 70 % av patienterna med nefropatisk cystinosis av nordeuropeisk härkomst är homozygota för denna mutation52 .Bendavid och kollegor har utvecklat fluorescens-in-situ-hybridiseringsprober för denna stora deletion, den första i sitt slag för en lysosomal lagringsstörning.55 Separata mutationer med förmodad grundareffekt har identifierats i Franska Kanada56 (W138X, av irländskt ursprung) och i Bretagne-provinsen i Frankrike57 (en splice-site-mutation i slutet av exon 8). En återkommande missense-mutation (G339R) har identifierats i två särskilda etniska populationer: två obesläktade familjer av amish-mennonitisk härkomst och fem obesläktade familjer av judisk-marockanskt ursprung.58-61 Ytterligare 50 mutationer av CTNS har också identifierats, inklusive minst tre patienter med mutationer i genens promotorområde.62 Patienter med juvenil eller okulär cystinos är homozygota för en ”mildare” mutation, vanligtvis en punktmutation utan störning av den öppna läsramen; alternativt är dessa patienter sammansatta heterozygoter för en mild mutation och en allvarligare mutation.17,59
Cystinosin uttrycks i stor utsträckning, med särskilt riklig transkription i bukspottkörteln, muskler och njurar.50 Immunohistokemi med antikystinosin-antikroppar63 och transfektion av celler med epitopmärkt komplementärt DNA (cDNA)64,65 avslöjar att proteinet uttrycks i lysosomer. Som förväntat är uttrycket av cystinosin särskilt robust i den proximala tubuli i njurarna.63 Lokaliseringen av cystinosin till det lysosomala membranet är beroende av både ett tyrosinbaserat GYDQL-lysosomalt sorteringsmotiv som är placerat på den C-terminala svansen och av en YFPQA-pentapeptid i den femte intertransmembranslingan. YFPQA-motivet är något unikt eftersom det är ett sällsynt exempel på en lysosomal sorteringssignal som är belägen utanför den cytoplasmatiska svansen.64 Det verkar uppvisa en viss förmåga att på egen hand rädda cystinosins sortering, med tanke på att en cystinosin-mutant med ett frånvarande GYDQL-motiv men med ett intakt YFPQA-motiv fortfarande delvis lokaliseras till lysosomer.65 En minoritet av cystinosismutationerna påverkar den lysosomala inriktningen av cystinosin, på grund av primärt avbrott i GYDQL-motivet eller på grund av ännu inte karakteriserade effekter på sekundärstrukturen.66
Funktionell karakterisering av cystinosin utnyttjade omdirigeringen av proteinet till plasmamembranet i en mutant, cystinosin-.GYDQL, som saknar det C-terminala GYDQL-motivet.67 Cystinosin-.GYDQL fungerar således som en H+-driven cystintransportör vid plasmamembranet i transfekterade celler. Den är mycket specifik för L-cystin; andra aminosyror, särskilt monosulfiden cystein, är inte substrat. Cystinosin är mättbart och följer Michaelis-Menton-kinetiken, med ett Km för cystin på ∼280 μM.67 Inåtriktad transport stimuleras avsevärt av ett extracellulärt pH-värde som är surt på utsidan (Fig. 14-6); kollaps av denna transmembranära H+-gradient genom tillsats av nigericin upphäver transporten, vilket är förenligt med H+-cystin-kotransport genom cystinosin. Lysosomal cystintransport är i sin tur beroende av närvaron av adenosintrifosfat (ATP), som ger bränsle till det lysosomala H+-ATPaset och driver utflödet av cystin (Fig. 14-7).46,68,69
Cystinosin-.GYDQL-konstruktionen har utnyttjats för funktionell karakterisering av sjukdomsassocierade missense mutationer i cystinosin. För det mesta korrelerar transport och kliniska fenotyper, med upphävande av transport genom mutationer som är associerade med nefropatisk cystinos och kvarvarande funktion förmedlad av konstruktioner som uttrycker mutationer som är associerade med juvenila och okulära subtyper av sjukdomen.66 Vissa mutationer associerade med juvenil cystinosis upphäver dock transporten i samband med cystinosin-.GYDQL, vilket tyder på att dessa mutationer har mindre effekter på cystinosin i full längd som uttrycks i lysosomala membran; en möjlighet är att cystinosin interagerar med lysosomala proteiner som stabiliserar dessa särskilda muterade former.66 Det omvända förekommer också, så att vissa nefropatiska cystinosismutationer har minimal effekt på den transport som medieras av cystinosin-.GYDQL.66
Targeted deletion av cystinosin hos möss leder till cystinackumulering i flera organ, inklusive njuren.70 Focala avlagringar av cystinkristaller kan detekteras i flera vävnader, bland annat inom proximala tubuliceller. Dessa möss uppvisar dock ingen proximal tubulopati, vilket tyder på att ackumulationen av cystinkristaller i sig inte är sjukdomsorsakande.70 Okulära anomalier hos cystinosinbristande möss är dock mycket lika patienter med cystinos. Dessa djur utvecklar således korneala cystinkristallinlagringar och depigmenterade fläckar i näthinnan, vilket tyder på en retinopati70
.