Elisabeth gifte sig 1559 med Filip II av Spanien, son till Karl V, tysk romersk kejsare, och Isabella av Portugal. Ursprungligen gifte hon sig via ombud i Notre Dame (med hertigen av Alba som ställföreträdare för Filip) innan hon lämnade Frankrike, men den egentliga ceremonin ägde rum i Guadalajara, Spanien, när hon anlände. Äktenskapet var ett resultat av freden i Cateau Cambrésis (1559). Hans andra hustru, Maria I av England, hade nyligen dött, vilket gjorde Elisabeth av Valois till Filips tredje hustru.
Vid bröllopet träffade hon målaren Sofonisba Anguissola och Ana de Mendoza, som skulle leva med henne resten av hennes liv. Filip II utsåg Anguissola till hovmästare och hovmålare åt sin drottning. Under Anguissolas ledning förbättrade Elisabeth sina kunskaper i amatörmålning. Anguissola påverkade också de konstnärliga arbeten som hennes barn, Isabella Clara Eugenia och Caterina Michaela, utförde under sin tid vid hovet.
Philip var helt förtrollad av sin 14-åriga brud, och 1564 hade han gett upp sina otrohetsaffärer. Trots den betydande åldersskillnaden var Elisabeth också ganska nöjd med sin make (i brev till sin mor förklarade hon sig lyckligt lottad över att ha gift sig med en så charmig prins). Filip gillade att anordna riddarturneringar för att underhålla sin hustru. Elisabeth spelade länsfru åt de tre unga prinsarna vid det spanska hovet: Carlos, prins av Asturien, Johannes av Österrike (oäkta son till Karl V) och Alexander Farnese, hertig av Parma (son till Karl V:s oäkta dotter Margareta).
Elisabeth hade ursprungligen varit trolovad med Filips son, Carlos, prins av Asturien, men politiska komplikationer gjorde det oväntat nödvändigt att i stället gifta sig med Filip. Hennes förhållande till sin oroliga styvson Carlos var varmt och vänskapligt. Trots rapporter om hans alltmer bisarra beteende var Carlos alltid snäll och vänlig mot Elisabeth. När det så småningom blev nödvändigt för Filip att låsa in honom (vilket kort därefter ledde till prinsens död) grät Elisabeth i flera dagar.
Philip var mycket fäst vid Elisabeth och stannade nära vid hennes sida även när hon var sjuk i smittkoppor. Elisabeths första graviditet 1560 resulterade i en dödfödd son, som 1564 följdes av ett missfall med tvillingflickor. Hon födde senare infanta Isabella Clara Eugenia av Spanien den 12 augusti 1566 och sedan Isabellas yngre syster Catherine Michelle av Spanien den 10 oktober 1567. Phillip och Elisabeth stod båda sina döttrar mycket nära och köpte sylt, dockor, leksaker med mera till dem. Det sägs att ”båda gladde sig åt Isabellas födelse som om det hade varit en sons födelse”. Elisabeth fick ännu ett missfall den 3 oktober 1568 och dog samma dag tillsammans med sin nyfödda lilla dotter.
Efter Elisabeths död erbjöd Katarina de’ Medici sin yngre dotter Margareta som brud åt Filip. Filip avböjde erbjudandet.