Fossiliserad hud avslöjar samevolution med fjädrar och ämnesomsättning hos dinosaurier med fjädrar och tidiga fåglar

Fossil mjukvävnadsstruktur

Små vävnadsfläckar (0,01-0,4 mm2; fig. 1a-d och kompletterande figurer 2-6) är nära förbundna med fossila fjädrar (dvs, vanligtvis inom 500 µm från kolhaltiga fjäderrester, kompletterande fig. 2e, g, j, k, o, s, t). Fläckarna är definitivt av fossil vävnad och återspeglar inte ytkontaminering med modernt material under provberedningen, eftersom de är bevarade i kalciumfosfat (se ”Taphonomi” nedan); dessutom uppvisar flera prover marginaler som delvis överlappas av den omgivande matrisen. Vävnaderna har därför inte helt enkelt fastnat på provytan som ett resultat av kontaminering från luftburna partiklar i laboratoriet.

Vävnadsfläckarna är typiskt 3-6 µm tjocka och plana (fig. 1a-e). Tvärsnitt och frakturytor visar ett inre fibröst lager (1,0-1,2 µm tjockt) mellan två tunnare strukturlösa lager (0,2-0,5 µm tjocka) (fig. 1f-h). Det strukturlösa skiktets yttre yta är slät och kan uppvisa en subtil polygonal textur definierad av polygoner som är 10-15 µm breda (fig. 1e, h).

Det fibrösa skiktet uppvisar också polygoner (fig. 1f, h och 2a-e samt kompletterande fig. 6) som innehåller matriser av tätt packade fibrer som är 0,1-0,5 µm breda (fig. 2f-i samt kompletterande fig. 5f). Välbevarade fibrer uppvisar spiralformade vridningar (fig. 2h, i). Fibrerna i de marginella delarna av varje polygon är 0,1-0,3 µm breda och orienterade parallellt med vävnadsytan; fibrerna i de inre delarna av varje polygon är 0,3-0,5 µm breda och vanligen vinkelräta mot vävnadsytan (fig. 2b, h och kompletterande fig. S6d). I de marginella 1-2 µm av varje polygon är fibrerna vanligen ortogonala till den laterala polygonmarginalen och slutar vid eller överbryggar korsningen mellan intilliggande polygoner (fig. 2f, g och kompletterande fig. 6e). Polygonerna är vanligen jämndimensionella men är lokalt förlängda och inbördes inriktade, där de tjocka fibrerna i varje polygon är subparallella till vävnadsytan och de tunna fibrerna är parallella med polygonens kant (fig. 2j, k och kompletterande fig. 6g-l). Vissa polygoner uppvisar en central fördjupning (fig. 2c-e och kompletterande fig. 6a-c) där de tjocka fibrerna kan omsluta en 1-2 µm bred globulär struktur (fig. 2e).

Fossila corneocyter

Teknikten hos dessa fossila vävnader skiljer sig från texturen hos conchostracanernas skal och fiskfjäll från värdsedimentet, skalet hos den moderna Mytilus, modernt och fossilt fjäderspirax och modernt reptilepidermis (kompletterande fig. 7a-n). Den långsträckta geometrin hos vissa polygoner (fig. 2j, k och kompletterande fig. 6g, l) antyder elastisk deformation av en icke-biomineraliserad vävnad på grund av mekanisk belastning. På grundval av deras storlek, geometri och inre struktur tolkas de polygonala strukturerna som korneocyter (epidermala keratinocyter). Hos moderna amnioter är dessa polyhedrala tillplattade celler (1-3 µm × ca 15 µm) fyllda med keratintonofibriller, lipider och matrisproteiner18,19,20 (fig. 3a, b och kompletterande fig. 2u-x, 8, 9). Det fossila materialets yttre strukturlösa skikt motsvarar cellranden; det är tjockare än den ursprungliga biologiska mallen, dvs. det hornhåriga cellhöljet och/eller cellmembranet, men detta är inte oväntat och återspeglar diagenetisk överväxning med kalciumfosfat (se ”Taphonomi”). Fibrerna i de fossila korneocyterna identifieras som mineraliserade tonofibriller: raka, oförgrenade buntar av superspolade α-keratinfibriller som är 0,25-1 µm breda18,21 och som är huvudkomponenten i korneocyternas cytoskelett22 och som är omslutna av amorfa cytoskelettproteiner22. I fossilerna gränsar de tunna tonofibrillerna ofta mot den intilliggande cellens (fig. 2g och kompletterande fig. 6e), men kan lokalt överbrygga gränsen mellan intilliggande celler (fig. 2f). Det sistnämnda påminner om desmosomer, områden med stark intercellulär fastsättning mellan moderna korneocyter23. De centrala globulära strukturerna i de fossila korneocyterna påminner om döda cellkärnor24, liksom i korneocyter från nuvarande fåglar (men inte från nuvarande reptiler och däggdjur)24 (kompletterande fig. 8). Placeringen av dessa pyknotiska kärnor indikeras ofta av fördjupningar i corneocytens yta hos levande fåglar24 (fig. 3b); vissa fossila celler uppvisar liknande fördjupningar (fig. 2c och kompletterande fig. 6a-c).

Taphonomi

Keratin är en relativt motsträvig biomolekyl på grund av sin starkt tvärbundna parakristallina struktur och hydrofoba, opolära karaktär23. Replikering av de fossila corneocyterna i kalciumfosfat är därför något oväntat eftersom denna process vanligtvis kräver branta geokemiska gradienter som är karakteristiska för tidig nedbrytning25 och vanligtvis gäller för nedbrytningsbenägna vävnader, t.ex. muskler26 och matsmältningsvävnader27. Återkallande vävnader, t.ex. hudkollagen, kan dock replikeras i kalciumfosfat där de innehåller en inneboende källa till kalcium och framför allt fosfatjoner som frigörs under sönderfallet28. Korneocyter innehåller källor till båda dessa joner. Under den terminala differentieringen ökar de intracellulära koncentrationerna av kalcium29 och α-keratinkedjorna fosforyleras i stor utsträckning23. Vidare är korneocyternas lipidgranuler30 rika på fosfor och fosfat31. Dessa kemiska enheter skulle frigöras vid nedbrytning av granulerna och fällas ut på det återstående organiska substratet, dvs. tonofibrillerna.

I existerande däggdjur kräver tätt packade matriser av tonofibriller rikligt med interkeratinmatrisproteiner för stabilitet32. Dessa proteiner är dock inte uppenbara i fossilerna. Detta är inte oväntat, eftersom proteinerna är sällsynta i befintliga aviära korneocyter33 och, vilket är kritiskt, förekommer som spridda monomerer34 och skulle ha en lägre bevarandepotential än tonofibrillernas starkt tvärbundna och polymeriserade keratinbuntar. Det yttre strukturlösa skiktet i de fossila korneocyterna är tjockare än den eller de troliga biologiska mallarna, dvs. det korneösa cellhöljet (ett lager av lipider, keratin och andra proteiner som är upp till 100 nm tjockt och som ersätter cellmembranet under den terminala differentieringen34 ) och/eller cellmembranet. Detta kan återspegla en lokal mikromiljö som främjar utfällning av kalciumfosfat: under den terminala differentieringen ansamlas granuler av keratohyalin, ett kraftigt fosforylerat protein35 med hög affinitet för kalciumjoner36, i periferin av de framväxande korneocyterna37. Tjockleken på det yttre fasta lagret av kalciumfosfat i fossilerna, plus den gradvisa övergången från detta till det inre fibrösa lagret, tyder på att utfällningen av fosfat fortsatte från marginalerna mot det inre av korneocyterna. I detta scenario skulle fosfattillgången i cellernas marginalzoner ha varit större än vad som krävs för att replikera tonofibrillerna. Det extra fosfatet skulle ha fällts ut som kalciumfosfat i de interstitiella utrymmena mellan tonofibrillerna, med en utveckling inåt från cellmarginalens insida.

Hudavfall hos dinosaurier med fjäderdräkt och tidiga fåglar

I existerande amnioter är det epidermala korneolitiska lagret typiskt sett 5-20 celler tjockt (men tjockleken varierar mellan olika arter och plats på kroppen38). De fossila korneocyternas fläckar är dock en celltjocklek (fig. 1f och kompletterande fig. 5c, 10). Detta, plus den konsekventa småskaligheten (<400 μm) hos fläckarna och den anmärkningsvärt höga bevaringsnoggrannheten, är inte förenligt med ett selektivt bevarande av ett kontinuerligt ark av in situ-vävnad. I en minoritet (n = 8) av exemplen förekommer huden i kanten av provet av fossila mjukvävnader och skulle därmed potentiellt kunna representera ett mindre fragment av en ursprungligen större bit fossil hud (med resten av biten på den fossila plattan). I de flesta exemplen ligger dock hela konturerna av hudfragmentet inom kanten av provet. En undersökning av marginalerna till olika prover i hög förstoring avslöjar att provet och det omgivande sedimentet ofta ligger i exakt samma plan (t.ex. kompletterande fig. 10). Även när marginalen av hudprovet är täckt av sediment är det osannolikt att provet har varit mycket större än den skenbara storleken eftersom det fossila skinnet, som är nästan perfekt plant, bildar ett naturligt delningsplan.

Det finns inget som tyder på att den bevarade tjockleken på skinnet är en artefakt av preparering eller erosion. Under klyvning av en stenplatta passerar klyvningsplanet ofta genom de mjuka vävnaderna på ett ojämnt sätt och blottar strukturer på olika djup. I de fossil som studerats här passerar klyvningsplanet vanligtvis genom korneocyterna (vilket blottar deras inre struktur) och sällan längs korneocytskiktets utsida. Det finns inga belägg för att mer än ett lager korneocyter har avlägsnats: FIB-sektioner visar att endast ett lager är bevarat och flera SEM-bilder visar kompletta vertikala sektioner genom den bevarade huden (där förhållandet till det över- och underliggande sedimentet är synligt), med bevis för endast ett enda lager av korneocyter. Den fibrösa inre fyllningen av de fossila korneocyterna exponeras där det fossila skivans delningsplan passerar genom vävnadsfläckarna. De fossila korneocyternas topografi varierar dock med läget för klyvningsplanet, som kan variera lokalt genom de mjuka vävnaderna på millimeterskala: korneocyterna kan uppvisa upphöjda marginaler och en central fördjupning, eller med nedtryckta marginaler och en central förhöjd zon (Fig. S9).

Storleken, den oregelbundna geometrin och tjockleken på fläckarna av korneocyter påminner om avlagda flingor av det förhornade skiktet (mjällliknande partiklar39; Fig. 3). Hos fåglar som finns kvar avges korneocyter individuellt eller i fläckar på upp till 0,5 mm2 som kan dras in i fjädrar (fig. 3c, d och kompletterande fig. 2u, v). De fossil som beskrivs här ger de första bevisen för hudavfallsprocessen hos basala fåglar och icke-aviära maniraptoriska dinosaurier och bekräftar att åtminstone vissa icke-aviära dinosaurier avlägsnar sin hud i små fläckar40. Denna avfallsform är identisk med den hos moderna fåglar18 (fig. 3c, d) och däggdjur20 och innebär en kontinuerlig somatisk tillväxt. Detta står i kontrast till många existerande reptiler, t.ex, lepidosaurier, som tappar sin hud helt eller i stora delar21, men avfallsformen kan påverkas av faktorer som kost och miljö41.

Evolutionära implikationer av fossila corneocyters struktur

De fossila corneocyterna uppvisar viktiga anpassningar som återfinns i deras motsvarigheter hos existerande fåglar och däggdjur, särskilt deras tillplattade polygonala geometri och fibrösa cellinnehåll som stämmer överens med α-keratintonofibriller16. Vidare visar de fossila tonofibrillerna (liksom i extanta exempel22) robusta intercellulära förbindelser och bildar en kontinuerlig ställning över korneocytskiktet (fig. 2b, c, j och kompletterande fig. 6). Däremot innehåller korneocyter hos utdöende reptiler en homogen massa av β-keratin (med ytterligare proteiner som finns i cellhöljet) och smälter samman under utvecklingen och bildar mogna β-skikt utan distinkta cellgränser42. Bibehållandet av pyknotiska kärnor i de fossila korneocyterna är ett tydligt aviärt kännetecken som inte ses hos moderna reptiler (men se ref. 20).

Epidermal morfogenes och differentiering anses ha divergerat hos therapsider och sauropsider31. Våra data stöder andra bevis för att gemensamma epidermala kännetecken hos fåglar och däggdjur tyder på konvergent utveckling43 och tyder på att lipidrika korneocyter kan vara evolutionärt härledda karaktärer hos fåglar och fjäderförsedda icke-aviära maniraptorer. Evo-devo-studier har föreslagit att fåglarnas epidermis kan ha uppstått genom expansionen av gångjärnsregioner i ”protofjäder”-bärande fjällhud20. Även om fossila bevis för denna övergång saknas, visar våra data att epidermis hos basala fåglar och icke-aviära maniraptoriska dinosaurier redan hade utvecklat en klart modern karaktär, även hos taxa som inte kan flyga med motor. Detta utesluter inte möjligheten att åtminstone några av de epidermisdrag som beskrivs här har sitt ursprung i mer basala theropoder, särskilt där bevarad hud saknar tecken på fjäll (som hos Sciurumimus44). Förfinade genomiska mekanismer för att modulera det komplexa uttrycket av keratin i epidermis45, den terminala differentieringen av keratinocyter och fördelningen av α- och β-keratinsyntesen i huden hos djur med fjäderdräkt32 modifierades troligen i takt med fjäderevolutionen nära basen av Maniraptora i slutet av den mellersta juraen (fig. 4). Befintliga fossila data tyder på att detta skedde efter utvecklingen av näbben hos Maniraptoriformes och före utvecklingen av frambenens patagia och pterylae (Fig. 4); de första fossila förekomsterna av alla dessa egenskaper sträcker sig över ca 10-15 Ma, vilket tyder på en explosion av innovationer i utvecklingen av fjäderdräktens integument nära och över gränsen mellan nedre och mellersta jurassic. Det tidigaste beviset på att det finns muskulatur i huden i samband med fjädrar är ca 30 Ma yngre, hos en ornithothoracean fågel från 125 Ma17. Med tanke på den viktiga roll som detta dermala nätverk spelar för fjäderstödet och kontrollen av fjäderns orientering18 kan dess frånvaro hos fjäderförsedda icke-aviära maniraptorer återspegla en tafonomisk bias.

I vissa avseenden är de fossila korneocyterna tydligt icke-aviära och indikerar att fjäderförsedda dinosaurier och tidiga fåglar hade en unik integumentär anatomi och fysiologi som var övergående mellan de moderna fåglarnas och de icke-fjäderförsedda dinosauriernas. Hos existerande fåglar är corneocyternas tonofibriller löst spridda bland intracellulära lipider19; detta underlättar evaporativ kylning som svar på värmeproduktion under flygning och isolering genom fjäderdräkten46. Däremot är de fossila tonofibrillerna tätt packade och fyller cellens inre. Det finns inga belägg för att de fossila corneocyterna skulle ha krympt efter döden: storleksintervallet stämmer överens med dem hos moderna fåglar, och det finns inga belägg för diagenetisk rynkning, konturering eller separation av enskilda celler. Detta tyder starkt på att den bevarade tätheten av tonofilament i de fossila corneocyterna återspeglar ursprungligen högre tätheter än hos nuvarande fåglar. Detta är inte en funktion av kroppsstorlek: existerande fåglar av olika storlek (t.ex. zebrafink och struts) uppvisar löst spridda tonofibriller47. De fossila fåglarna har därför sannolikt haft ett lägre fysiologiskt behov av evaporativ kylning och i sin tur en lägre kroppsvärmeproduktion relaterad till flygaktivitet46 än hos moderna fåglar. Detta stämmer överens med andra bevis för låg basal ämnesomsättning hos icke-aviära maniraptoriska dinosaurier47,48 och basala fåglar47 och med hypoteser om att fjädrarna hos Microraptor49 och eventuellt Confuciusornis48 (men se ref. 50) inte var anpassade för motorflygning, åtminstone inte under längre tidsperioder50.

.