Lösningsstruktur, glykanspecificitet och fenoloxidashämmande aktivitet hos Anopheles C-typ lektiner CTL4 och CTLMA2

Konservering av CTL4/CTLMA2 i Anopheles

CTL4 och CTLMA2 består båda av en signalpeptid, en kort N-terminal sekvens som innehåller CXCXC-motivet, och en enda CTL-domän. En nyligen publicerad rapport tyder på att funktionen hos CTL4 och CTLMA2 eller deras kofaktorer har divergerat inom Anopheles, och specifikt att An. albimanus CTL4 inte innehåller de N-terminala cysteinresterna som är involverade i disulfidlänkar22. Vi undersökte först på nytt ortologerna av CTL4 (AGAP005335) och CTLMA2 (AGAP005334), som har en nära rygg-till-rygg-orientering på kromosom 2L (Fig. 1a), med hjälp av de aktuella genmodellerna (från och med februari 2019) i Vectorbase24. Vi hittade proteiner med ett N-terminalt CXCXC-motiv för 15/16 CTL4-ortologer, inklusive An. albimanus AALB014534, och 13/14 CTLMA2-ortologer. Vi utförde multipla sekvensanpassningar av både CTL4 och CTLMA2 från 10 asiatiska, afrikanska och Nya världens Anopheles-arter (fig. 1b). De orotade fylogenetiska träden har nästan identisk topologi, och ett kombinerat fylogenetiskt träd har två symmetriska grenar, med undantag för positionen för An. dirus med avseende på An. funestus och An. maculatus.

Figur 1
figur1

Konservering av CTL4 och CTLMA2 i Anopheles. (a) Schematisk bild som illustrerar back-to-back arrangemanget av An. gambiae CTL4 och CTLMA2 på kromosom 2 L. (b) Orotade fylogenetiska träd för CTL4 (blått), CTLMA2 (rött) i tio Anopheles-arter inklusive An. gambiae (lila) och An. albimanus (cyan). Den N-terminala delen av båda multi-sekvensanpassningarna visas med bevarade cysteinrester gulmarkerade, andra bevarade rester gråmarkerade. CXCXC-motivet är bevarat i alla sekvenser utom de som är trunkerade vid N-terminus.

Detta stödjer hypotesen att CTL4 och CTLMA2 är bevarade inom Anopheles-släktet, med saknade ortologer som återspeglar ofullständig annotering av vissa genomer. Vi undersökte den genomiska regionen hos tre arter med en rapporterad CTL4-ortolog men ingen CTLMA2-ortolog: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 och An. melas AMEC014491. Alla har en nära eller överlappande gen i omvänd riktning – ASTE002636, AMIN007379 och AMEC088499, som omfattar två CTL-domäner. För An. stephensi och An. minimus föregås den andra CTL-domen av ett CXCXC-motiv, vilket tyder på att de kan vara CTLMA2-ortologer. Hos Aedes- och Culexmyggor är situationen mindre klar. En CTLMA2-ortolog med ett N-terminalt CXCXC-motiv är annoterad i Ae. albopictus, AALF001196, och har en nära back-to-back inverterad två-exon-gen AALF001195, som består av ett serinproteas och en CTL-domän. Genmodellen från oktober 2018 för Ae. aegypti omfattar en CTLMA2-ortolog med N-terminalt CXCXC-motiv, CTLMA14 (AAEL014382), som för närvarande förtecknas som en CTL4-ortolog). En CTLMA2-ortolog är annoterad i C. quinquefasciatus, CPIJ000443, men saknar det N-terminala CXCXC-motivet. Detta tyder på att CTLMA2 uppstod i en gemensam förfader till Anopheles och Aedes medan CTL4 kan vara Anopheles-specifik.

Biokemisk karakterisering

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 och CTLMA2 CRDs (Fig. S1a) och An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) uttrycktes i insektsceller med hjälp av baculovirus expressionsvektorsystem (BEVS) och renades till homogenitet. Den mogna AgCTL4 (25-177) har en molmassa på 17,3 kDa och pI 7,7. Den mogna AgCTLMA2 (18-174) har en molmassa på 17,9 kDa och pI 4,5. Den renade heterodimern har en molekylvikt på 35 kDa på icke-reducerande (NR) SDS-PAGE (fig. 2a) och elueras som en enda topp på storleksexklusionskromatografi (SEC) med en skenbar molekylvikt på 40 kDa (fig. 2b). Monomerer CTL4 och CTLMA2 uppträder på reducerande SDS-PAGE vid 17 kDa respektive 20 kDa. Som tidigare nämnts kan den ökade skenbara molekylvikten hos CTLMA2 återspegla dess ovanliga (sura) aminosyrafördelning20.

Figur 2
figur2

Biokemisk karakterisering av rekombinant CTL4/CTLMA2. (a) Renad An. gambiae CTL4/CTLMA2-heterodimer på icke-reducerande (NR) och reducerande (R) SDS-PAGE. Representativ för >10 oberoende experiment. (b) Anjonutbyte (MonoQ 10/10) och storleksexkludering (Superdex75 16/60) kromatogram för An. gambiae CTL4/CTLMA2. Små kryss anger medföljande SDS-PAGE-fraktioner, stora kryss anger SEC MW-standarder. Representativt för >10 oberoende experiment. (c) α6 × His (CTL4) och αCTLMA2 Western blotting för nio cysteinmutanter av CTL4/CTLMA2-heterodimern på icke-reducerande (NR) och reducerande (R) SDS-PAGE. I alla mutanter är heterodimerbildningen tydlig, även om den är mindre effektiv. Representativ för tre oberoende experiment. (d) Plott av C(s) mot s för sedimentationshastighet analytisk ultracentrifugering av 1 mg/ml CTL4/CTLMA2, 200 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5. Tre toppar med ökande sedimentationskoefficient observeras, s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Representativt för tre oberoende experiment. (e) Dynamisk ljusspridning av CTL4/CTLMA2 i förhållande till pH. Data anpassas till en sfärisk partikel vars radie återspeglar storleksfördelningen i lösningen, ingen trend syns i pH-området 6-9,5 för An. gambiae eller An. albimanus CTL4/CTLMA2 i antingen 1 mM EDTA eller 10 mM CaCl2. Resultat från ett av två oberoende experiment.

Det har visats att An. gambiae CTL4/CTLMA2 stabiliseras av en intermolekylär disulfid mellan cysteinerna i det N-terminala CXCXC-motivet; mutation av dessa tre cysteinerna till alanin upphäver disulfidbildningen mellan kedjorna20. För att ytterligare förfina placeringen av interkedjedisulfiden konstruerade vi nio mutanter som innehåller en enda cystein i CTL4:s och CTLMA2:s N-terminala CXCXC-motiv, samexponerade proteinerna i Sf9-celler och utförde Western Blotting för att detektera CTL4 och CTLMA2. Intermolekylär disulfidbildning var ineffektiv men tydlig på icke-reducerande SDS-PAGE i alla fall (fig. 2c).

Detta tyder på att N-terminal intermolekylär disulfidbildning mellan CTL4 och CTLMA2 är promiskuös, snarare än att involvera en specifik cysteinrest från varje protein. Om intermolekylär disulfidbildning är promiskuös kan CTL4/CTLMA2-heterodimerer i princip bilda multivalenta disulfidbryggade oligomerer. Inga disulfidlänkade oligomerer upptäcks dock på NR-SDS-PAGE för An. gambiae CTL4/CTLMA2 (fig. 2a). På samma sätt kan CTL4 och CTLMA2 bilda disulfidbryggade homodimerer in vitro20 , men den renade produkten är till övervägande del (>95 %) heterodimer. Några mindre band (~10 %) observeras på NR-SDS-PAGE för An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) som kan representera homodimer- eller oligomerbildning.

Både An. gambiae CTL4/CTLMA2 och An. albimanus CTL4/CTLMA2 är polydisperse i lösning. Icke-kovalent oligomerisering av högre ordning är tydlig som en axel av huvudtoppen i SEC med ökande koncentration och är mer uttalad för An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Vi bekräftade förekomsten av oligomeriska arter genom analytisk ultracentrifugering med sedimentationshastighet (AUC) (fig. 2d). Vid pH 7,5 observeras en serie arter med avtagande intensitet i c(s)-fördelningen: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomeriseringen är oberoende av Ca2+ för A. gambiae CTL4/CTLMA2 men ökar väsentligt med Ca2+ för A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) och är inte korrelerad med pH enligt dynamisk ljusspridning (DLS) (Fig. 2e).

Kalciumbindning

Som CTL:er kan både CTL4 och CTLMA2 binda kalcium. De kanoniska Ca2+-bindningsresterna i CTL4 är dock muterade, vilket tyder på att det kan vara en CTLD men inte en CRD av C-typ. Därför mätte vi kalciumbindningsaffiniteten hos An. gambiae CTL4, CTLMA2 och CTL4/CTLMA2-heterodimern från An. gambiae och An. albimanus genom isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Under likvärdiga förhållanden observerades bindning för CTLMA2 och CTL4/CTLMA2, men inte för CTL4 (fig. 3a-c). Bindningskonstanter och termodynamiska parametrar beräknades från resultaten av tre oberoende experiment (tabell 1). CTLMA2 Ca2+-bindning passar väl in i en modell med en enda plats med KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. An. gambiae CTL4/CTLMA2:s affinitet för kalcium är ~40 × högre än CTLMA2 med KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (fig. 3d) har en liknande affinitet för kalcium med KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Kalciumbindningen till både An. gambiae och An. albimanus CTL4/CTLMA2 var dock substoikometrisk (N = 0,36-0,50).

Figur 3
figur3

ITC-bindningsisoterm för kalciumbindning. (a) An. gambiae CTL4, (b) An. gambiae CTLMA2, (c) An. gambiae CTL4/CTLMA2, (d) An. albimanus CTL4/CTLMA2. Proteinkoncentrationen i cellen var 100 μM, Ca2+ (CaCl2) koncentrationen i sprutan var 2,5 mM för monomerer, 1,25 mM An. gambiae CTL4/CTLMA2, 0,8 mM för An. albimanus CTL4/CTLMA2. Ingen bindning är uppenbar för CTL4, svag bindning för CTLMA2 och stark bindning för CTL4/CTLMA2. Representativ för tre oberoende experiment.

Tabell 1 Kalciumbindning av CTL4 och CTLMA2 med ITC*.

Glykanbindning

CTL4 och CTLMA2 tillhör linjen av myeloida CTL:er – inklusive makrofag mannosereceptor (MMR) och DC-SIGN – som bildar en bevarad familj av immunreceptorer i metazoer15,25. Bland CTL:er med känd struktur har CTLMA2 30 % sekvensidentitet med kolhydratigenkänningsdomänen (CRD) hos musens scavengerreceptor (SCRL, PDB ID 2OX9)26 och svinets surfaktantprotein D (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 behåller rester som är associerade med Ca2+-bindning i den glykanbindande slingan och det kanoniska EPN-motivet som är associerat med D-mannoseselektivitet (fig. 4a). CTL4 saknar däremot alla rester som är associerade med Ca2+-bindning, vilket stämmer överens med det faktum att ingen bindning observerades med ITC. Den enda kända CTL-strukturen med stor likhet med CTL4 är faktor IX/X-bindningsprotein (X-bp) från giftet från den kinesiska mockasinen Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp är en modifierad CTLD där den glykanbindande domänen är ersatt av en lång slinga som förmedlar dimerisering för att generera faktor IX/X-bindningsstället. Även om vissa insekts-CTL inte kräver kalcium för glykanbindning är det därför oklart om CTL4 överhuvudtaget ska binda glykaner.

Figur 4
figur4

Upplösningsspridningsdata och modell för CTL4/CTLMA2. (a) Sekvensanpassning för An. gambiae och An. albimanus CTL4 och CTLMA2 med musens scavengerreceptor CTLD (SCRL, PDB ID 2OX9) och svinets surfaktantprotein D (SP-D, PDB ID 4DN8). Identiskt bevarade rester är markerade med svart. Rester i Ca2+/glykanbindningsslingan är markerade med rosa. Rester av CTL4:s basiska slinga 1 är markerade med blått, CTLMA2:s sura slinga 1-rester med rött. (b) Molekylär modell för CTL4 (grön) och CTLMA2 (orange). Ca2+/glykanbindande slinga markerad i rosa. Cysteiner i disulfidbindningar visas som gula pinnar. Baserat på närheten till det N-terminala CXC-motivet för att bilda en intermolekylär disulfid, skulle den troliga orienteringen av CRD:erna i CTL4/CTLMA2-heterodimern ha utåtriktade Ca2+/glykanbindande slingor och inåtriktade laddade slingor. (c) Kurva för röntgenspridning med liten vinkel för A. gambiae CTL4/CTLMA2. (inskjutet) Guinier-plott (PRIMUS), RG = 24,5 Å. (d) P(r)-fördelning (GNOM), Dmax = 80 Å. (inskjutet) anpassning till spridningskurvan, RG = 25,4 Å. (e) CTL4/CTLMA2-modeller som härrör från en 3-tillståndsanpassning till spridningskurvan (MULTIFOXS). En modell är anpassad till den mest sannolika av 20 ab initio-pärlmodeller som anpassats till P(r)-fördelningen (DAMMIF). Mätningar som härrör från ett enda experiment.

För att definiera deras lektinaktivitet analyserade vi CTL4, CTLMA2 och CTL4/CTLMA2-heterodimern på glykanmatriser som visar 367 unika glykanstrukturer28. Dessa studier visade på bindning till en rad olika glykaner (tabell 2). Monomerer av CTL4 och CTLMA2 visade sig binda till endast fyra respektive sex glykaner, medan heterodimern band 18 olika glykaner. Det finns märkbara skillnader mellan de ligander som binds av de enskilda monomererna och heterodimern. 3/4 (75 %) av de glykaner som känns igen av CTL4 och 2/6 (33 %) av de glykaner som känns igen av CTLMA2 känns inte igen av CTL4/CTLMA2.

Tabell 2 Glykan array-resultat för CTL4 och CTLMA2*.

För att bekräfta glykan array-resultaten och för att bestämma bindningspreferenser för CTL:erna utfördes SPR-analys (tabell 3). I nästan alla interaktioner stämde glykanarray och SPR överens om förekomsten av interaktioner med SPR som indikerade att glykanarray hade fyra falskt negativa resultat: CTLMA2-monomer med H-antigen, kondroitinsulfat och kondroitin-6-sulfat och CTL4-monomer med kondroitin-6-sulfat. Alla de falskt negativa resultaten visade dock bindning på matrisen med CTL4/CTLMA2-heterodimern.

Tabell 3 Ytplastmonresonans (SPR) av CTL4/CTLMA2 med glykaner.

CTL:erna kände inte igen mannosinnehållande glykaner, med undantag för mannos-6-fosfat av CTL4/CTLMA2, trots det kanoniska EPN-motivet som finns i CTLMA2. De strukturer som känns igen är snarare generellt sett glykosaminoglykanmotiv (GAG) som omfattar β1-3/β1-4-länkningar mellan glukos (Glc), galaktos (Gal) och deras respektive hexosaminer GlcNac och GalNac. Galβ1-4Glc-länkningen fanns i 12/23 (52 %) av de erkända glykanerna, inklusive 6/23 (26 %) som innehöll Galβ1-4GlcNac och 4/23 (17 %) som innehöll keratanmotivet Galβ1-4GlcNac β1-3Gal eller GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

Arrayen uppvisade också en viss preferens för polymera och sulfaterade glykaner. Av de fyra glykaner som erkändes av CTL4 var den starkaste träffen för globopentaos (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 band också HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n och β1-3Glukan (Glcβ1-4Glc)n. Tre av fem glykaner som erkändes av CTLMA2-monomern var sulfaterade, och CTL4/CTLMA2-heterodimern kände igen kondroitinsulfat och kondroitin-6-sulfat, hyaluronsyra (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 och HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Dessa resultat tyder på att det finns distinkta och synergistiska effekter av heterodimerisering på glykanbindning.

Både CTLMA2 och CTL4/CTLMA2-heterodimern känner igen flera fukosinnehållande sockerarter, inklusive sialyl-LewisX och sulfo-LewisA men inte sialyl-LewisA. Den högsta affinitetsbindningen observerades till sulfo-LewisA med bindning till CTLMA2- (106 nM) och CTL4/CTLMA2-komplexet (95 nM) vid en KD på ~100 nM (tabell 3). Den högsta affinitetsbindningen som observerades för CTL4 var också till en sulfaterad glykan, sulfo-laktosamin (292 nM).

Strukturanalys

För att ytterligare undersöka strukturen hos CTL4 och CTLMA2 genererade vi strukturmodeller av CTL4 och CTLMA2 (Fig. 4b) med hjälp av MODELLER29 med ytterligare manuell redigering. Både CTL4 och CTLMA2 har en förlängd slinga (slinga 1) som följer CTLD:s andra helix (fig. 4a) med en hög densitet av komplementärt laddade rester; basiska rester för CTL4 och sura rester för CTLMA2. Den komplementära elektrostatiken hos dessa loop 1-rester och deras närhet till det N-terminala CXCXC-motivet tyder på att detta är ett potentiellt protein/protein-gränssnitt inom heterodimern (Fig. 4b), för vilket en hypotetisk modell genererades med en enda disulfidbindning i CXCXC-motivet. Glykan/Ca2+-bindningsslingorna är dock ett andra potentiellt gränssnitt, vilket observerades för de två kedjorna av D. acutus X-bp. Den alternativa hypotesen är att de två CTL-domänerna är oberoende av varandra, med flexibla länkare som förenar dem via den intermolekylära hypotesen.

För att testa denna hypotes analyserade vi lösningsstrukturen för CTL4/CTLMA2 med hjälp av småvinkelröntgenspridning (SAXS). Experimenten genomfördes i 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 och 1 % glycerol för att minimera interpartikelinteraktioner. Under dessa förhållanden uppvisade proteinet ett linjärt samband mellan extrapolerad intensitet vid nollvinkeln och koncentration (I0 vs. c) upp till en koncentration på 3,1 mg/ml. Den buffertsubtraherade kurvan för intensiteten I vs q (fig. 4c) lades in i SAXSMoW2 som ger RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) och molekylvikten MW = 39 kDa, endast 11 % större än den förväntade heterodimerns MW på 35 kDa30. Den beräknade Guinier-plotten är dock baserad på endast sju datapunkter; anpassning över ett utökat område (fig. 4c, inset) ger RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), medan anpassning av den parvisa fördelningsfunktionen P(r) (fig. 4d) ger ett RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). P(r)-fördelningen anpassas av DAMMIF31 med 20 ab initio-pärlmodeller med en genomsnittlig normaliserad strukturell diskrepans NSD = 1,0 ± 0,2. Huvuddelen av ab initio-modellerna har en liknande form som den förväntade CTL4/CTLMA2-heterodimern.

En ytterligare densitet sträcker sig från huvuddelen av pärlmodellerna som kan återspegla antingen den N-terminala sekvensen av båda proteinerna inklusive CXCXC-motivet, eller en mindre population av CTL4/CTLMA2 med en högre gyrogrationsradie. För att testa denna hypotes utförde vi multi-state-modellering av SAXS-profilen med programmet MULTIFOXS32. Vi genererade en komplett modell för CTL4-6xHis/CTLMA2 med en N-terminal coiled-coil som avslutas av en intermolekylär disulfid mellan CTL4 C39 och CTLMA2 C34. MULTIFOXS genererade en ensemble av 10 000 varianter av modellen för att jämföra med den experimentella spridningskurvan. De enda flexibla resterna var CTL4 40-45 och 178-183 (6xHis) och CTLMA2 35-39, med en N-terminal spiral som fungerar som en stel kropp som förbinder de två kedjorna. Den bästa modellen med ett tillstånd passade till data med χ2 = 1,13 och hade RG = 23,7 Å. Den minsta χ2 = 1,07 uppnåddes med en modell med tre tillstånd (fig. 4e), där 80 % av spridningen bidrar till två kompakta modeller med RG = 22,0 Å och RG = 23,7 Å. Dessa data stämmer överens med bildandet av en kompakt heterodimer mellan CTL4 och CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 hämmar fenoloxidasaktivering som svar på E. coli

CTL4 och CTLMA2 fungerar som hämmare av myggans melaniseringssvar på infektion. Det har tidigare rapporterats att knockdown av CTL4 inte ledde till ökad fenoloxidasaktivitet (PO) som svar på infektion med en blandning av E. coli och S. aureus20. I samma studie konstaterades dock att dsCTL4- och dsCTLMA2-myggor var specifikt mottagliga för gramnegativa bakterier. Därför undersökte vi på nytt effekten av knockdown av CTL4 och CTLMA2 på hemolymfens PO-aktivitet som svar på enbart E. coli-infektion (fig. 5a). 4 timmar efter infektionen med E. coli var PO-aktiviteten signifikant ökad för dsCTL4 (p = 0,02) och dsCTLMA2 (p = 0,004) myggor jämfört med dsLacZ-kontroller (fig. 5b). Den genomsnittliga knockdown-effektiviteten för CTL4 och CTLMA2 var 93 ± 3 % respektive 89 ± 3 %, med >80 % i varje enskilt experiment.

Figur 5
figur5

Rekombinant CTL4/CTLMA2 hämmar fenoloxidas (PO)-aktivitet efter E. coli-utmaning (a) Försöksupplägg för mätning av PO-aktivitet i hemolymfa 4 timmar efter E. coli-utmaning (OD 0,8). PO-aktiviteten bestämdes genom att mäta A492 1 timme efter att hemolymphe kombinerats med substratet L-3,4-dihydroxifenylalanin (L-DOPA) enligt beskrivningen i Material & Metoder. (b) Förbättrad E. coli-inducerad PO-aktivitet i hemolymfa i dsCTL4 och dsCTLMA2 knockdowns. *0,017, **0,0035 (n = 3, Tukey’s multiple comparisons test) (c) Samtidig knockdown av TEP1 (dsTEP1), jämfört med LacZ-kontrollen (+BSA), reverserar förstärkningen av E. coli-inducerad hemolymph PO-aktivitet i dsCTL4-myggor. ***0,001 (dsCTL4/dsLacZ vs. dsLacZ/dsLacZ), ***0,006 (dsCTL4/dsTEP1vs. dsCTL4/dsLacZ) (n = 3, Tukey’s multipla jämförelser). (d) Samtidig administrering av rekombinant CTL4/CTLMA2 (+CTLs), jämfört med BSA-kontroll (+BSA), reverserar förstärkningen av E. coli-inducerad hemolymph PO-aktivitet hos dsCTL4-myggor. **0,007, ****1,8 × 10-5 (n = 3, tvåsidigt heteroscedastiskt student-test). Staplarna representerar medelvärde ± SD där p ≤ 0,05 anses vara signifikant.

Melanisering av Plasmodium ookinetes vid CTL4/CTLMA2 silencing är beroende av LRIM117,22, TEP133 och SPCLIP133. Eftersom dessa är alla delar av det TEP1-komplementliknande immunsvaret, resonerade vi att ökad PO-aktivitet i avsaknad av CTL4 borde vara TEP1-beroende. Följaktligen jämförde vi ökningen av PO-aktiviteten i dsCTL4-myggor med samtidig administrering av dsTEP1 med samtidig administrering av dsLacZ (fig. 5c). Den genomsnittliga knockdown-effektiviteten för TEP1 var 82 ± 9 % och >80 % i 5/6 experiment (64 % i ett experiment). Det fanns faktiskt ingen signifikant ökning av PO-aktiviteten hos dsCTL4-myggor när TEP1 också tystades. Detta bekräftar att melanisering i avsaknad av CTL4/CTLMA2 är TEP1-beroende.

Ko-administrering av rekombinant CTL4/CTLMA2 med E. coli reverserade signifikant förstärkningen av PO-aktiviteten hos dsCTL4-myggor jämfört med BSA (p = 0,007, fig. 5d). Dessa resultat visar att CTL4/CTLMA2 är direkt involverad som en negativ regulator av PO-aktiviteten. I dsLacZ-myggor dämpade CTL4/CTLMA2 dock inte E. coli-inducerad PO-aktivitet jämfört med bovint serumalbumin (BSA). Den E. coli-inducerade PO-aktiviteten hos dsCTL4-myggor som saminjicerats med rekombinant CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTLs) var också högre än hos dsLacZ-myggor som saminjicerats med BSA (dsLacZ + BSA). Injicering av rekombinant CTL4/CTLMA2 räddar alltså inte helt och hållet förlusten av endogent protein.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.