Laboratoriedetektion och identifiering av Aspergillus-arter genom mikroskopisk observation och odling: det traditionella tillvägagångssättet

Abstract

Molekylära och immunologiska tester lovar en bättre och snabbare laboratoriediagnostik av aspergillos, men mikroskopi och odling förblir vanligt förekommande och viktiga verktyg. Procedurförändringar samt adekvat utbildning av laboratoriepersonal kan öka värdet av dessa traditionella verktyg. Användning av Blankophor eller Calcofluor vid mikroskopiska undersökningar, förbättrat igenkännande av morfologiska egenskaper hos opportunistiska svampar i färgade utdrag av prover, maximering av tillväxthastigheten och produktionen av konidier hos Aspergillus spp. i odling samt igenkännande av atypiska varianter av vanliga aspergiller kan förbättra laboratoriets bidrag till en snabb diagnos. Undersökningar visar att antalet laboratoriepersonal minskar samtidigt som efterfrågan på hälso- och sjukvård ökar. Effektiv rekrytering, bibehållande och utbildning av personal måste ske samtidigt med tekniska framsteg.

Introduktion

Traditionella metoder för diagnostik av aspergillos och andra mykoser kompletteras med molekylära och immunologiska metoder. Även om fördelarna med nukleinsyrabaserade tester är uppenbara, har deras standardisering och kliniska användbarhet inte förverkligats fullt ut . Även om galaktomannan EIA-testet för Aspergillus-antigen är allmänt tillgängligt i USA verkar standardanvändningen av nukleinsyrabaserade tester för identifiering av kliniska isolat vara begränsad. Referenslaboratorier som erbjuder molekylär identifiering av aspergilli inkluderar Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Nederländerna, och laboratorier i USA som är förtecknade i Association for Molecular Pathologys online-testkatalog. Även om molekylära metoder fortsätter att förbättras och blir mer lättillgängliga är mikroskopi och odling fortfarande de viktigaste laboratorieverktygen för att upptäcka aspergilli. Enligt 2003 års Benchmarking Survey från American Society for Microbiology (ASM) använder 89 % av de laboratorier som utför mykologiska tester odling, 16 % serologi och färre än 5 % molekylära tester. Endast 3 % av de rapporterande laboratorierna använder ”hemmagjorda” molekylära tester för mikrobiella patogener. Med tanke på det fortsatta beroendet av mikroskopi och odling måste dessa metoders diagnostiska värde förbättras genom procedurförändringar och adekvat utbildning av laboratoriepersonal.

Mikroskopi

Mikroskopiska metoder, t.ex. våtmontering, Gram-färgningar och konventionell histopatologi, ger ledtrådar som tyder på närvaron av Aspergillus spp. i vävnad. Blankophor eller Calcofluor blandat med 10-20 % kaliumhydroxid (KOH) färgar svampens cellväggar och förbättrar upptäckten av svampar. Calcofluor kristalliserar i ett alkaliskt pH-värde, medan Blankophor inte gör det och kan lagras i en arbetslösning i upp till ett år. Fenotypiska markörer som upptäcks genom histopatologiska färgningar, liksom genom Gram-färgning eller våtmontering, ger värdefull information om kliniskt viktiga svampar, särskilt i avsaknad av odling (tabell 1). Bekräftelse av mikroskopiska fynd genom odling är dock alltid önskvärd och, i de flesta fall som rör opportunistiska mögelsvampar, nödvändig för definitiv identifiering av patogenen. Trots förekomsten av visuella ledtrådar kan identifiering av aspergilli med enbart mikroskopi vara missvisande. Schell rapporterar ett fall av bihåleinflammation orsakad av Aspergillus niger där A. nigers konidier förväxlades med jästceller från Candida spp. och tvärsnitt av A. nigers stipes förväxlades med de breda hyferna från en zygomycet. Kommunikation mellan den kliniska patologen och laboratoriemykologen, som rutinmässigt identifierar filamentösa svampar från odling, kan förbättra histopatologins diagnostiska värde.

Har identifiering av morfologiska egenskaper

Då aspergilli är allestädes närvarande i naturen kan de ofta kontaminera prover och odlingsmedier. Följaktligen är det ofta en utmaning att fastställa betydelsen av Aspergillus spp. som växer i kultur när mikroskopisk undersökning av provet är negativ. I en undersökning av Aspergillus-isolat från mottagare av lever- och njurtransplantat fann Brown et al. att närvaron av mer än två kolonier i en odling och infektion på mer än en plats förutsade en betydande infektion. Hos granulocytopeniska patienter med akut leukemi måste en enda isolering från ett prov från de nedre luftvägarna betraktas som signifikant . Tydliga rapporter om laboratorieobservationer till läkaren kan minska det diagnostiska dilemmat. Till exempel ger uttalandet ”Totalt tre kolonier av Aspergillus fumigatus isolerade på två av tre plattor” mer information än ”Sällsynt A. fumigatus isolerad”.

Optimering av odlingsresultat

Isolering i odling och fenotypisk identifiering av vanliga kliniska isolat av Aspergillus spp. är vanligen snabb och enkel. Odling beskrivs dock ofta som långsam, vilket kanske skapar missuppfattningar om dess värde för upptäckt av aspergiller. A. fumigatus är en snabbväxare. De typiska velutinösa, gråblågröna kolonierna och de uniserata konidiehuvudena utvecklas inom 24-48 timmar på både svampmedier och den fårblodagar som vanligen används för bakterieodling. Andra aspergiller som förknippas med invasiv aspergillos, närmare bestämt A. flavus, A. niger, A. nidulans och A. terreus, har en tillväxthastighet som liknar den för A. fumigatus när kolonier mättes på maltextraktagar och Czapek-jästagar efter sju dagars inkubation vid både 25 °C och 37 °C . Eftersom läkemedelsresistens hos vissa Aspergillus spp. är ett hot är en fullständig identifiering motiverad, inte bara av A. fumigatus utan även av de mindre vanligt isolerade arterna. Laboratorieforskare måste också känna igen atypiska isolat av Aspergillus spp. Nyligen rapporterades dåligt sporulerande (vita) stammar av A. fumigatus med minskad känslighet för flera svampdödande läkemedel . Dessa vita stammar har en genetisk sekvens som skiljer sig från vildtypen A. fumigatus Fresenius och utvecklade inte de typiska blågröna konidiehuvudena förrän 10-12 dagar efter inkubation. En annan utmaning är det vita möglet Neosartorya fisheri, som till en början producerar glesa konidiehuvuden som liknar dem från A. fumigatus. N. fisheri utvecklar dock senare många, runda, tunnväggiga cleistothecier, vilket gör det enkelt att skilja dem från A. fumigatus. Ett dissektionsglas är praktiskt för att snabbt lokalisera konidiehuvuden och cleistothecia. Sterila, vita, snabbväxande eller kala, upphöjda, långsamt växande isolat av A. fumigatus kan förekomma, vilket kräver termotolerans och exoantigen-testning för definitiv identifiering. Khan et al. rapporterade en atypisk A. terreus isolerad från prover från nedre luftvägarna från en patient med aspergillom. De första kolonierna var orange och producerade ett diffust gult pigment och små, enskilda celler som kunde förväxlas med konidier från Scedosporium apiospermum. Utfällande antikroppar och typiska konidiehuvuden från A. terreus som producerades efter 10 veckors inkubation bekräftade identifieringen.

De bilder och den information som finns tillgänglig i läroböcker och på Internet erbjuder fina utbildningsmöjligheter för att lära sig identifiera Aspergillus spp. Praktisk erfarenhet förblir dock det mest effektiva undervisningsverktyget. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) och CBS erbjuder laboratorieverkstäder. När det inte är praktiskt möjligt att resa utanför laboratoriernas lokaler uppmuntras laboratorierna att använda online-handledningen Aspergillus Reference Cultures för intern utbildning. De referensorganismer som förtecknas där kan köpas från större kultursamlingar.

Analys av varje steg i odlingsförfarandet kan leda till förbättrad återvinning av aspergilli. Det har föreslagits att proverna ska förvätskas med Sputolysin eller andra mucolytiska medel för att få fram svampar som fastnat i slemmet i sputum och bihålsmaterial från endoskopisk kirurgi . Användning av potatisdextros, potatisflingor, maltextrakt, hämmande mögelagar eller liknande sporulationsagar som primära isoleringsmedier för Aspergillus spp. kan påskynda tillväxten och produktionen av konidier. Tillsats av antibakteriella medel till isoleringsmedier bidrar till att förkorta tiden till identifiering genom att hämma bakteriell överväxt och minska behovet av subkultur. Den inledande inkuberingen av svampmedier vid 35-37 °C i stället för eller utöver 30 °C kan påskynda tillväxten av vissa aspergilli . På samma sätt säkerställer daglig inspektion av odlingsmedier en så tidig upptäckt som möjligt. Genom att inkubera odlingsplattor i en mikroaerofil miljö vid 35 °C fann Tarrand att utvalda, kliniskt viktiga Aspergillus spp. växte från 12 av 12 buljongkulturer. Odlingar av samma organismer som inkuberades vid 25 °C utan koldioxid gav inga positiva resultat. Ytterligare studier skulle vara till hjälp för att klargöra vilka medier och förhållanden som är mest effektiva för återhämtning och snabb identifiering av kliniskt viktiga aspergilli.

Med en snabb Scotch-tape- eller tease-montering kan konidiehuvuden av Aspergillus spp. vanligtvis identifieras. En objektsodling kan dock vara nödvändig när sporuleringen är långsam eller atypisk. Det snabba tempot på de flesta sjukhuslaboratorier kräver den enklaste, men inte nödvändigtvis den mest raffinerade, metoden för att utföra en diakultur. Riddells klassiska metod har kompletterats med andra, mindre arbetskrävande tekniker. En snabb metod är att helt enkelt trycka in ett 18 × 18 mm stort täckglas i en 45 graders vinkel i ett sporulationsmedium, t.ex. potatisflake agar. När mögelsvampen sporulerar tas täckglaset försiktigt ut ur agaren och monteras i en droppe laktofenolblått eller laktofuchsin på ett mikroskopglas. Ytterligare en droppe placeras ovanpå det lilla täckglaset innan monteringen avslutas med ett 22 × 22 mm stort täckglas.

Frågor som rör arbetskraften

Snabb diagnostik av aspergillos är inte bara beroende av förbättrad metodik utan också av en adekvat, välutbildad arbetskraft. Undersökningar av mykologiska metoder rekommenderar starkt mer utbildning . Särskild vikt bör läggas vid korrekt identifiering, direkt undersökning, lämplig användning av medier, klinisk relevans och kostnadseffektivitet. Otillräcklig personal kan dock äventyra både utbildningen och genomförandet av mer kliniskt relevanta förfaranden. ASM:s Benchmarking Survey visade att det fortfarande råder brist på personal vid vissa mikrobiologiska laboratorier i USA. Delvis beror bristen på en 53-56-procentig minskning av CLS-utbildningsprogrammen under de senaste 12 åren. Trettiofyra procent av de yrkesverksamma som arbetar i mikrobiologiska laboratorier idag är över 50 år gamla. Kommer det att finnas yngre arbetstagare som kan ersätta dem när de går i pension? Medan nästan 80 procent av kvinnorna i arbetskraften är yngre än 30 år, är endast 10 procent av de kvinnliga arbetstagarna i mikrobiologiska laboratorier yngre än 30 år . Dessa uppgifter tyder på att bristen på arbetskraft kommer att fortsätta och eventuellt förvärras.

Slutsats

För att förbättra både traditionella och icke-traditionella diagnostiska förfaranden för mykoser krävs samtidiga insatser för att säkerställa en tillräcklig arbetskraft och för att förbättra karriärrörligheten, det yrkesmässiga erkännandet, möjligheterna till vidareutbildning, ersättningen och andra faktorer som behövs för att stimulera intresset för laboratorievetenskap.