Mikrobiologi

Under transkriptionsprocessen, transkriberas den information som kodas i DNA-sekvensen i en eller flera gener till en RNA-sträng, även kallad ett RNA-transkript. Den resulterande enkelsträngade RNA-molekylen, som består av ribonukleotider som innehåller baserna adenin (A), cytosin (C), guanin (G) och uracil (U), fungerar som en rörlig molekylär kopia av den ursprungliga DNA-sekvensen. Transkription hos prokaryoter och eukaryoter kräver att DNA:s dubbelspiral delvis avvecklas i området för RNA-syntesen. Det avvecklade området kallas transkriptionsbubbla. Transkriptionen av en viss gen sker alltid från en av de två DNA-strängar som fungerar som mall, den så kallade antisense-strängen. RNA-produkten är komplementär till DNA-mallsträngen och är nästan identisk med den DNA-sträng som inte är mallen, eller sense-strängen. Den enda skillnaden är att i RNA är alla T-nukleotider ersatta med U-nukleotider; under RNA-syntesen inkorporeras U när det finns ett A i den komplementära antisense-strängen.

Transkription i bakterier

Bakterier använder samma RNA-polymeras för att transkribera alla sina gener. Liksom DNA-polymeras lägger RNA-polymeras till nukleotider en efter en till 3′-OH-gruppen i den växande nukleotidkedjan. En avgörande skillnad i aktivitet mellan DNA-polymeras och RNA-polymeras är kravet på en 3′-OH-grupp att lägga till nukleotider på: DNA-polymeras kräver en sådan 3′-OH-grupp och därmed en primer, medan RNA-polymeras inte gör det. Under transkriptionen läggs en ribonukleotid som är komplementär till DNA-mallsträngen till den växande RNA-strängen och en kovalent fosfodiesterbindning bildas genom dehydratiseringssyntes mellan den nya nukleotiden och den senast tillsatta nukleotiden. I E. coli består RNA-polymeras av sex polypeptidunderenheter, varav fem utgör polymerasets kärnenzym som ansvarar för att lägga till RNA-nukleotider till en växande sträng. Den sjätte underenheten är känd som sigma (σ). σ-faktorn gör det möjligt för RNA-polymeras att binda till en specifik promotor, vilket möjliggör transkription av olika gener. Det finns olika σ-faktorer som möjliggör transkription av olika gener.

Initiering

Initieringen av transkriptionen börjar vid en promotor, en DNA-sekvens på vilken transkriptionsmaskineriet binder sig och initierar transkriptionen. Det nukleotidpar i DNA-dubbelhelixen som motsvarar den plats från vilken den första 5′ RNA-nukleoiden transkriberas är initieringsstället. Nukleotider som föregår initieringsstället kallas ”uppströms”, medan nukleotider som följer efter initieringsstället kallas ”nedströms” nukleotider. I de flesta fall är promotorer placerade precis uppströms de gener som de reglerar. Även om promotorsekvenserna varierar mellan bakteriegenomerna finns det några få element som är bevarade. Vid positionerna -10 och -35 i DNA:t före initieringsstället (betecknat +1) finns det två konsensussekvenser för promotorer, eller regioner som är likartade i alla promotorer och i olika bakteriearter. Konsensussekvensen -10, som kallas TATA-boxen, är TATAAT. Sekvensen -35 känns igen och binds av σ.

Förlängning

Förlängningen i transkriptionsfasen börjar när σ-underenheten dissocieras från polymeraset, vilket gör det möjligt för kärnenzymet att syntetisera RNA som är komplementärt till DNA-mallen i 5′- till 3′-riktningen med en hastighet av cirka 40 nukleotider per sekund. När elongationen fortskrider avvecklas DNA:t kontinuerligt framför kärnenzymet och rullas tillbaka bakom det (figur 1).

Figur 1. Under elongationen spårar det bakteriella RNA-polymeraset längs DNA-mallen, syntetiserar mRNA i 5′ till 3′-riktningen och rullar av och tillbaka DNA:t när det läses.

Terminering

När en gen har transkriberats måste det bakteriella polymeraset dissociera sig från DNA-mallen och frigöra det nytillverkade RNA:t. Detta kallas för terminering av transkriptionen. DNA-mallen innehåller upprepade nukleotidsekvenser som fungerar som termineringssignaler, vilket får RNA-polymeraset att stanna upp och frigöra sig från DNA-mallen, vilket frigör RNA-transkriptet.

Transkription i eukaryoter

Prokaryoter och eukaryoter utför i princip samma transkriptionsprocess, med några få betydande skillnader (se tabell 1). Eukaryoter använder tre olika polymeraser, RNA-polymeras I, II och III, som alla skiljer sig strukturellt från det bakteriella RNA-polymeraset. Var och en transkriberar en annan undergrupp av gener. Intressant nog innehåller arkéer ett enda RNA-polymeras som är närmare besläktat med eukaryotiskt RNA-polymeras II än med dess bakteriella motsvarighet. Eukaryotiska mRNA är också vanligen monokistroniska, vilket innebär att de var och en kodar för endast en enda polypeptid, medan prokaryotiska mRNA från bakterier och arkéer vanligen är polycistroniska, vilket innebär att de kodar för flera polypeptider.

Den viktigaste skillnaden mellan prokaryoter och eukaryoter är den sistnämndas membranbundna cellkärna, vilket påverkar hur lätt det är för RNA-molekylerna att användas för proteinsyntes. Med generna bundna i en kärna måste den eukaryota cellen transportera proteinkodande RNA-molekyler till cytoplasman för att översättas. Proteinkodande primära transkript, de RNA-molekyler som syntetiseras direkt av RNA-polymeras, måste genomgå flera bearbetningssteg för att skydda dessa RNA-molekyler från nedbrytning under den tid som de överförs från kärnan till cytoplasman och översätts till ett protein. Exempelvis kan eukaryotiska mRNA:er hålla i flera timmar, medan det typiska prokaryotiska mRNA:et inte håller i mer än 5 sekunder.

Det primära transkriptet (även kallat pre-mRNA) beläggs först med RNA-stabiliserande proteiner för att skydda det från nedbrytning medan det bearbetas och exporteras ut ur kärnan. Den första typen av bearbetning börjar medan det primära transkriptet fortfarande syntetiseras; en speciell 7-metylguanosinnukleotid, kallad 5′ cap, läggs till i 5′-änden av det växande transkriptet. Förutom att förhindra nedbrytning känner faktorer som är involverade i den efterföljande proteinsyntesen igen locket, vilket hjälper till att initiera översättningen av ribosomerna. När förlängningen är avslutad lägger ett annat bearbetningsenzym till en sträng av cirka 200 adeninnukleotider i 3′-änden, som kallas poly-A-halsen. Denna modifiering skyddar pre-mRNA ytterligare från nedbrytning och signalerar till cellulära faktorer att transkriptet måste exporteras till cytoplasman.

Eukaryotiska gener som kodar för polypeptider består av kodande sekvenser som kallas exoner (ex-on anger att de uttrycks) och mellanliggande sekvenser som kallas introner (int-ron anger deras mellanliggande roll). Transkriberade RNA-sekvenser som motsvarar introner kodar inte för delar av den funktionella polypeptiden och avlägsnas från pre-mRNA under bearbetningen. Det är viktigt att alla intron-kodade RNA-sekvenser avlägsnas fullständigt och exakt från ett pre-mRNA före proteinsyntesen, så att de exon-kodade RNA-sekvenserna kan fogas samman på rätt sätt för att koda för en funktionell polypeptid. Om processen felaktigt sker med bara en enda nukleotid skulle sekvenserna för de återförenade exonerna förskjutas, och den resulterande polypeptiden skulle vara icke-funktionell. Processen att ta bort intron-kodade RNA-sekvenser och återförena dem som kodas av exoner kallas RNA-splicing och underlättas av en spliceosom som innehåller små nukleära ribonukleproteiner (snRNPs). Intron-kodade RNA-sekvenser avlägsnas från pre-mRNA medan det fortfarande befinner sig i kärnan. Även om de inte översätts verkar introner ha olika funktioner, bland annat genreglering och mRNA-transport. När dessa modifieringar är avslutade transporteras det mogna transkriptet, det mRNA som kodar för en polypeptid, ut ur kärnan, med destination cytoplasma för översättning. Introner kan splicas ut på olika sätt, vilket resulterar i att olika exoner inkluderas eller utesluts från den slutliga mRNA-produkten. Denna process är känd som alternativ splicing. Fördelen med alternativ splicing är att olika typer av mRNA-transkript kan genereras, som alla härstammar från samma DNA-sekvens. På senare år har det visat sig att vissa arkéer också har förmågan att skarva sitt pre-mRNA.