Proteiner

Lysozym var det första enzym för vilket röntgenstrukturen bestämdes med hög upplösning. Detta gjordes 1965 av David Phillips, som arbetade vid Royal Institution i London. Phillips fortsatte med att föreslå en mekanism för lysozymets verkan som huvudsakligen baserades på strukturella data. Phillips mekanism har sedan dess bekräftats av experimentella bevis, vilket vi kommer att se senare.

Lysozym finns i stor utsträckning i celler och sekret (inklusive tårar och saliv) hos ryggradsdjur, och hönsäggvita är särskilt rik på detta enzym. Lysozym katalyserar hydrolysen av glykosidbindningar som binder N-acetylmuraminsyra (NAM) och N-acetylglukosamin (NAG) i polysackarider i bakteriella cellväggar. Därigenom skadar den cellväggens integritet och fungerar därmed som ett bakteriedödande medel. NAM-NAG-bindningen visas i figur 40, där platsen för lysozymets klyvning anges.

Figur 40 Del av polysackaridkomponenten i bakteriella cellväggar, som visar de alternerande N-acetylmuraminsyra- (NAM) och N-acetylglukosaminresterna (NAG). Denna polysackarid är ett substrat för lysozym, som hydrolyserar den glykosidiska bindningen vid den angivna positionen. (För tydlighetens skull, och för att möjliggöra en linjär representation av molekylen, visas några av bindningarna i zick-zack-form.)

Lysozym är ett relativt litet enzym. Hönsäggsvitlysozym består av en enda polypeptid med en längd på 129 aminosyror (figur 41) med Mr 14 600. Från röntgendiffraktionsdata kan vi se att det finns en tydlig klyfta i lysozymstrukturen (figur 42). Den aktiva platsen är belägen i denna klyfta. I aminosyrasekvensen i figur 41 och i den rymdfyllande modellen av lysozym i figur 42 har de rester som kantar substratbindningsfickan i det veckade proteinet markerats.

Figur 41 Aminosyrasekvensen av hönsäggs lysozym, med de rester som kantar substratbindningsfickan markerade i grått. Asp 52 och Glu 35, nyckelrester i den aktiva platsen, är markerade med rött respektive gult.

Figur 42 En rymdfyllnadsmodell av hönsäggsvit lysozym där nyckelrester har markerats. Asp 52 är röd; Glu 35 är gul; några av de rester som kantar substratbindningsfickan visas i grått.

Den aktiva platsen för lysozym är ett långt spår som kan rymma sex sockerarter i polysackaridkedjan åt gången. När enzymet binder polysackariden hydrolyserar det en av glykosidbindningarna. Om de sex sockerarterna i polysackaridsträckan identifieras som A-F, ligger klyvningsstället mellan D och E, enligt figur 40. De två polysackaridfragmenten frigörs då. Figur 43 visar stegen i denna reaktion, som också beskrivs i detalj nedan.

Figur 43 Lysozymets katalytiska mekanism. Observera att endast nyckelrester som är involverade i katalysen (Glu 35 och Asp 52) visas. Stegen beskrivs i detalj i texten. (Baserat på Phillips, 1966)

1. Vid bindning till enzymet antar substratet en spänd konformation. Residue D är förvrängd (visas inte i diagrammet) för att rymma en -CH2OH-grupp som annars skulle få en ogynnsam kontakt med enzymet. På detta sätt tvingar enzymet substratet att anta en konformation som närmar sig övergångstillståndets konformation.

2. Residual 35 i enzymet är glutaminsyra (Glu 35) med en proton som den lätt överför till den polära O-atomen i den glykosidiska bindningen. På detta sätt klyvs C-O-bindningen i substratet (figur 43a och b).

3. Residue D i polysackariden har nu en positiv nettoladdning; denna reaktionsintermediär är känd som en oxoniumjon (figur 43b). Enzymet stabiliserar denna intermediär på två sätt. För det första interagerar en närliggande aspartatrest (Asp 52), som befinner sig i den negativt laddade karboxylatformen, med oxoniumjonens positiva laddning. För det andra gör förvrängningen av rest D att den positiva laddningen kan delas mellan dess C- och O-atom. (Observera att denna delning av laddning mellan atomer kallas för resonans på samma sätt som delningen av elektroner mellan atomerna i peptidgruppen). Oxoniumjonintermediären är således övergångstillståndet. Normalt skulle en sådan intermediär vara mycket instabil och reaktiv. Asp 52 bidrar till att stabilisera oxoniumjonen, men reagerar inte med den. Detta beror på att de reaktiva grupperna på 3 Ås avstånd är för långt ifrån varandra.

4. Enzymet frigör nu rest E med sin fastsatta polysackarid, vilket ger en glykosylenzymintermediär. Oxoniumjonen reagerar med en vattenmolekyl från lösningsmedelsmiljön, extraherar en hydroxylgrupp och reprotonerar Glu 35 (figur 43c och d).

5. Enzymet frigör sedan rest D med sin fastsatta polysackarid och reaktionen är avslutad.

Phillips-mekanismen för lysozymkatalysen, som beskrivs ovan, stöds av ett antal experimentella observationer. I synnerhet har betydelsen av Glu 35 och Asp 52 i processen bekräftats genom platsstyrda mutagenesiexperiment (SDM). SDM är en mycket kraftfull teknik för att undersöka den roll som enskilda aminosyrarester spelar för ett proteins funktion och kommer att diskuteras i detalj i avsnitt 7.2. SDM innebär att man använder rekombinant DNA-teknik för att selektivt ersätta den berörda aminosyrarest med en annan aminosyra med kritiskt annorlunda egenskaper. Det resulterande proteinet kan sedan testas funktionellt, t.ex. med avseende på substratbindning eller katalytisk aktivitet. När denna teknik tillämpades på lysozym för att ersätta Glu 35 med en glutaminrest (Gln) kunde det resulterande proteinet fortfarande binda substratet (om än mindre starkt), men det hade ingen katalytisk aktivitet. Glu 35 är därför nödvändigt för lysozymets katalytiska aktivitet. När Asp 52 ersattes med en asparaginrest (Asn) hade det muterade proteinet mindre än 5 % av den katalytiska aktiviteten hos normalt lysozym (vildtyp), trots att den muterade formen faktiskt hade en dubbelt så hög affinitet för substratet. Av detta följer att Asp 52 är nödvändig för lysozymets katalytiska aktivitet. Försök med kemiska medel som kovalent modifierade dessa rester, utan att röntgenstrukturen påverkades nämnvärt, visade på liknande sätt att de var nödvändiga för den katalytiska aktiviteten.