Abstract
Det har visats att replikationen av humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1) kvarstår hos de flesta infekterade individer som får högaktiv antiretroviral behandling (HAART). Studier som behandlar förhållandet mellan låga nivåer av pågående viral replikation och immunologiska parametrar, såsom förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler, hos sådana individer har dock saknats. Här visas ett statistiskt signifikant omvänt samband mellan frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler hos infekterade individer som får HAART och hos vilka plasmaviremi hade undertryckts under detektionsgränsen under längre tidsperioder. Ingen korrelation hittades mellan frekvensen av hiv-1-specifika cytotoxiska CD8+ T-lymfocyter (CTL) och förhållandet mellan CD4+ :CD8+ T-celler hos dessa individer. Dessa data tyder på att ihållande, låg nivå, pågående viral replikation, även om den inte är tillräcklig för att upprätthålla hiv-1-specifika CTL-svar, delvis kan förklara varför normalisering av förhållandet CD4+ :CD8+ T-celler inte uppnås hos vissa infekterade individer som framgångsrikt behandlas med HAART.
Användningen av högaktiv antiretroviral terapi (HAART) vid behandling av personer som är infekterade med humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1) har dramatiskt förändrat det kliniska utfallet för många infekterade personer och har lett till en avsevärd minskning av förekomsten av aids och av dödligheten . Förekomsten av replikationskompetent virus, hiv-1 proviralt DNA (inklusive 2 långa terminala upprepade cirklar), spliced och unspliced hiv-1 RNA i CD4+ T-celler och oidentifierade virusreservoarer har dock påvisats hos de flesta infekterade personer hos vilka plasmaviremi har sjunkit under detektionsgränsen, och dessa källor till pågående replikation har framstått som det största hindret för att förhindra utrotning av hiv-1 .
Efter inledandet av HAART minskar plasmaviremin snabbt till under detektionsgränsen hos en stor andel av de infekterade individerna och följs av en gradvis ökning av antalet CD4+ och minskning av antalet CD8+ T-celler. Normalisering av förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler uppnås dock inte hos vissa infekterade individer som annars framgångsrikt svarat på HAART . I detta avseende har det föreslagits att de kroniskt förhöjda nivåerna av CD8+ T-celler eller onormala CD4+:CD8+ T-cellsförhållandena i det perifera blodet drivs av aktiv viral replikation hos infekterade individer som är obehandlade eller får suboptimal antiviral behandling . Dessutom har uttrycket av aktiveringsmarkören CD38 på CD8+ T-celler visat sig vara en prognostisk markör för sjukdomsutveckling . Även om det har föreslagits att misslyckandet med att normalisera förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler hos vissa patienter som får HAART beror på ofullständigt undertryckande av viral replikation , finns det inga rapporterade uppgifter som direkt behandlar denna fråga, särskilt inte hos patienter som har fått HAART under lång tid och hos vilka plasmaviremi har undertryckts på ett bra sätt.
Det har fastställts att reservoaren av infekterade CD4+ T-celler i det perifera blodet, som bestäms av antalet celler som bär på hiv-1 proviralt DNA, upprätthålls genom pågående viral replikation, även vid mycket låga nivåer . I denna studie utvärderade vi förhållandet mellan förhållandet mellan antalet CD4+:CD8+ T-celler och frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA i renade CD4+ T-celler, samt frekvensen av hiv-specifika cytotoxiska CD8+ T-lymfocyter (CTL) hos infekterade individer som hade fått HAART under lång tid och hos vilka plasmaviremi har undertryckts till en nivå som är lägre än detektionsnivån, vilket bestämts med standardanalyser.
Patienter och metoder
Isolering av CD4+ T-celler. Mononukleära celler från perifert blod (PBMC) erhölls genom ficoll-hypaka densitetsgradientcentrifugering. CD4+ T-celler isolerades från PBMC från hiv-1-infekterade individer med hjälp av en kolonnbaserad cellseparationsteknik (Stem-Cell Technologies), enligt beskrivning på annat ställe.
Kvantitativ hiv-1-DNA-PCR i realtid. För att bestämma frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1-provirus hos infekterade individer utfördes en realtids-PCR enligt beskrivningen nedan. Genomiskt DNA isolerades från 1-2 × 106 renade CD4+ T-celler med hjälp av Puregene DNA-isoleringskit (Gentra) enligt tillverkarens specifikationer. DNA (1 µg) användes sedan som mall för realtids-PCR i en iCycler (Bio-Rad). Amplifikationsreaktionen utfördes i tre exemplar med 0,5 µM primers, 0,2 µM fluorescerande sond, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2 och 2,5 U Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) i en totalvolym på 50 mL. Primerna 5′- GGTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ primer) och 5′-CTGCTAGAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ primer) användes tillsammans med den fluorescerande sonden 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGTGTGTGCCCGTCTGTTTAMRA- 3′. PCR-förhållandena bestod av ett denatureringssteg vid 95 °C i 3 minuter, följt av 45 cykler om 15 s vid 95 °C och 1 minut vid 58 °C. Seriellt utspätt ACH-2 DNA utsattes också för ovanstående PCR för att erhålla standardkurvor.
Flödecytometrisk analys av hiv-1-specifika CD8+ T-celler. Frekvensen av CD8+ T-celler som är specifika för hiv-1 bestämdes genom analys av intracellulära interferon (IFN)-γ-positiva celler efter stimulering med hiv-1-specifika peptider (20 mer som överlappar 15 aa). Pooler av överlappande peptider (1 µg vardera; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) som spänner över hela hiv-1:s gag-, pol-, env- och nef-sekvenser inkuberades inledningsvis med 3 × 106 PBMC i 10 minuter i ett rundbottnat 5 ml-rör (Becton Dickinson) i 0,1 ml fullständigt medium i en 37°C CO2-inkuberingsmaskin. Därefter tillsattes 0,4 mL fullständigt medium till röret, och efter 2 timmars inkubation tillsattes Brefeldin A (Sigma) till mediet i en slutkoncentration på 10 mg/mL för att hämma utsöndringen av IFN-γ. Efter 6 timmars inkubation tvättades cellerna två gånger, fixerades med 1× fixeringslösning (Becton Dickinson) i 10 minuter i rumstemperatur och tvättades igen. Cellerna permeabiliserades med 1× permeabiliseringslösning 2 (Becton Dickinson) och inkuberades ytterligare i 10 min i rumstemperatur. Efter att ha tvättats igen färgades cellerna med följande antikroppar: fluoresceinisotiocyanatkonjugerade anti-CD8, fykoerythrinkonjugerade anti-IFN-γ, peridinin-klorofyllproteinkonjugerade anti-CD69 och allofykocyaninkonjugerade anti-CD3-antikroppar (Becton Dickinson). Med en gate på CD3+CD8+ lymfocyter samlades ~100 000 händelser in med hjälp av en FACSCalibur (Becton Dickinson), och frekvensen av IFN-γ + CD69+ celler bestämdes med hjälp av programvaran Cellquest (Becton Dickinson).
Statistisk analys. Spearmans rangkorrelation användes som ett mått på korrelationen mellan 1) frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och antalet CD4+ och CD8+ T-celler och förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler och 2) frekvensen av hiv-1-specifika CTL:er och antalet CD4+ och CD8+ T-celler, förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler och antalet CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA. Fishers exakta test användes för att fastställa sambandet mellan CD4+:CD8+ T-cellkvoten ⩾1,0 eller <1,0 och proviral belastning i CD4+ T-cellkompartmentet. Bonferronimetoden för justering av P-värden för multipel testning tillämpades på korrelationerna mellan antalet CD4+ och CD8+ T-celler och förhållandet CD4+:CD8+ T-celler och frekvensen av CD4+ T-celler som bär på proviralt hiv-1-DNA, och den tillämpades på korrelationerna mellan antalet CD4+ och CD8+ T-celler, förhållandet CD4+:CD8+ T-celler och nivåerna av proviralt hiv-1-DNA i CD4+ T-cellkompartmentet och frekvensen av hiv-1-specifika CTL:er.
Resultat
Korrelation mellan storleken på CD4+ T-cellsreservoaren av hiv-1 och immunologiska parametrar. För att undersöka sambandet mellan storleken på det perifera blodets CD4+ T-cellsreservoar för hiv-1 och onormala perifera immunologiska parametrar hos infekterade individer som får framgångsrik HAART under längre perioder försökte vi fastställa korrelationer mellan frekvensen av CD4+ T-celler som bär på proviralt DNA från hiv-1 och antalet CD4+ och CD8+ T-celler samt förhållandet CD4+ :CD8+ T-celler. Det fanns en statistiskt signifikant omvänd korrelation mellan frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och antalet CD4+ T-celler i det perifera blodet hos de infekterade individer som vi studerade (P = 0,02; figur 1A). Däremot hittades ingen korrelation mellan hiv-1 proviralt DNA i CD4+ T-celler och antalet CD8+ T-celler (P = 0,34; figur 1B). När dessa två immunologiska parametrar kombinerades och uttrycktes som förhållandet CD4+:CD8+ T-celler observerades en stark omvänd korrelation mellan dessa värden och frekvensen av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA (P .01; figur 1C). Dessutom hade 14 (74 %) av 19 patienter med förhållandet CD4+:CD8+ T-celler ,1,0 en proviral belastning av hiv-1 DNA på <1000 kopior/µg genomiskt DNA från CD4+ T-celler. Tvärtom hade 10 (77 %) av 13 patienter med förhållandet CD4+:CD8+ T-celler >1,0 en proviral belastning av hiv-DNA på ,1000 kopior/mg genomiskt DNA som härrörde från CD4+ T-celler (P = 0,01; figur 1C).
Samband mellan frekvensen av CD4+ T-celler som bär på proviralt DNA från humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1) och olika immunologiska parametrar. Genomiskt DNA isolerat från högt anrikade CD4+ T-celler från hiv-1-infekterade patienter som fick långvarig högaktiv antiretroviral behandling utsattes för hiv-1 long terminal repeat-specifik realtids-polymeraskedjereaktion i realtid, enligt beskrivningen i Patienter och metoder. Korrelationer bedömdes mellan frekvensen av celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och antalet CD4+ (A) och CD8+ (B) T-celler och förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler (C).
Samband mellan frekvensen av CD4+ T-celler som bär på humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1) proviralt DNA och olika immunologiska parametrar. Genomiskt DNA isolerat från högt anrikade CD4+ T-celler från hiv-1-infekterade patienter som fick långvarig högaktiv antiretroviral behandling utsattes för hiv-1 long terminal repeat-specifik realtids-polymeraskedjereaktion i realtid, enligt beskrivningen i Patienter och metoder. Korrelationer bedömdes mellan frekvensen av celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och antalet CD4+ (A) och CD8+ (B) T-celler och förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler (C).
Korrelation mellan frekvensen av hiv-1-specifika CTL:er och immunologiska och virologiska parametrar. Det har visats att frekvensen av hiv-1-specifika CTLs minskar gradvis efter inledandet av HAART hos hiv-1-infekterade individer på grund av den minskande tillgängligheten av hiv-1-antigener . Vi undersökte förhållandet mellan frekvensen av hiv-1-specifika CTLs och förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler hos infekterade individer som hade svarat framgångsrikt på HAART under längre tid. Ingen statistiskt signifikant korrelation hittades mellan frekvensen av CTL:er som svarade på hiv-specifika peptider som härrör från gag-, pol-, env- och nef-generna och CD4+:CD8+ T-cellskvoten (figur 2). Dessutom hittades ingen statistiskt signifikant korrelation mellan antalet hiv-1-specifika CTL:er och antalet CD4+ och CD8+ T-celler samt antalet CD4+ T-celler som bär på proviralt DNA från hiv-1 (data visas inte). Noterbart är att det fanns en tendens till högre antal CTLs hos individer med lägre CD4+:CD8+ T-cellskvoter.
Diskussioner
Den utbredda användningen av HAART vid behandling av hiv-1-sjukdom har lett till en dramatisk förbättring av det kliniska utfallet . Även om plasmaviremi kan hållas under detektionsgränsen hos många infekterade individer som får HAART, har persistensen av låga nivåer av pågående viral replikation i CD4+ T-celler utgjort ett stort hinder för att uppnå utrotning av hiv-1 . Ihållande låga nivåer av viral replikation anses vara den viktigaste faktorn för att upprätthålla reservoaren av hiv-1, vilket återspeglas av frekvensen av CD4+ T-celler som bär på proviralt DNA från hiv-1 hos patienter vars plasmaviremi har undertryckts av HAART till en nivå som ligger under den nivå som kan påvisas med standardtester . Dessutom har man observerat en ihållande nivå av förhöjda CD8+ T-celler hos en stor andel av de infekterade patienter som får HAART . I detta avseende har det föreslagits att aktiv virusreplikation är ansvarig för de förhöjda nivåerna av CD8+ T-celler och att uttrycksnivåerna av aktiveringsmarkören CD38 på dessa celler har visat sig vara en prognostisk markör för sjukdomsprogression i avsaknad av effektiv antiviral behandling .
Trots brist på publicerade data har det spekulerats i att inverterade förhållanden mellan CD4+ och CD8+ T-celler i det perifera blodet hos infekterade individer som behandlas framgångsrikt med HAART beror på låga nivåer av pågående viral replikation . I den här studien undersökte vi om de inverterade förhållandena mellan CD4+ och CD8+ T-celler hos vissa infekterade personer som fick HAART under längre tid berodde på ofullständigt undertryckande av hiv-1-replikation, vilket avspeglas av storleken på hiv-1:s provirala DNA-reservoar i CD4+ T-celler. Den ihållande närvaron av hiv-1 proviralt hiv-DNA i CD4+ T-cellkompartmentet hos infekterade patienter som får HAART har beskrivits på ett övertygande sätt på andra ställen och har ansetts avspegla en ofullständig hämning av en kvarvarande pågående viral replikation, trots att plasmaviremian har undertryckts till icke-detekterbara nivåer . Vi påvisade en stark invers korrelation mellan frekvensen av infekterade CD4+ T-celler som innehåller proviralt hiv-1-DNA och förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-celler, vilket tyder på att låga nivåer av kvarvarande viral replikation delvis kan ha varit orsaken till de onormala förhållandena mellan CD4+ och CD8+ T-cellerna i det perifera blodet.
Och även om frekvensen av CD4+ T-celler som bär på proviralt hiv-1-DNA kan vara direkt förknippad med förhållandet mellan CD4+ och CD8+ T-cellerna, kan andra faktorer påverka detta förhållande. Parametrar såsom förekomsten av okända virusreservoarer som stöder aktiv virusreplikation i närvaro av HAART, avvikelser i värdens immunsystem, styrkan hos givna terapeutiska regimer eller andra förvirrande faktorer kan ha en effekt på både CD4+: CD8+ T-cellerna och proviralDNA-belastningen i CD4+ T-cellerna. Det är värt att notera att våra data tyder på att pågående viral replikation på nivåer som inte kan påvisas med standardanalyser för plasmaviremi, men som upprätthåller CD4+ T-cellernas reservoar av HIV-1, även om det är tillräckligt för att förhindra normalisering av CD4+: CD8+ T-cellerna hos de patienter som undersöktes i denna studie är inte tillräckliga för att upprätthålla hiv-1-specifika CTL-svar.
Det kan hävdas att de ihållande onormala CD4+:CD8+ T-cellerna hos infekterade individer som får HAART under längre perioder också skulle kunna hänföras till både immunologiska och virologiska faktorer. I detta avseende har det visats att i avsaknad av sjukdomsprogression och tillräcklig återhämtning av CD4+ T-celler, upprätthålls den totala T-cellshomeostasen hos infekterade individer genom förhöjda nivåer av CD8+ T-celler som i sin tur kan störa regenerationen av CD4+ T-celler . Vi fann dock ingen korrelation mellan nivåerna av CD4+ T-celler som bär på hiv-1 proviralt DNA och antalet CD8+ T-celler.
Till sist har tidigare studier visat att genereringen av CD4+ T-celler i thymus allvarligt hindras av antingen direkta eller indirekta följder av aktiv viral replikation . I detta avseende har man hos infekterade individer påvisat minskade nivåer av thymusproduktion, mätt som frekvensen av naiva CD4+ T-celler som bär på T-cellreceptor-rearrangemangsexcisionskretsar . Även om det inte är klart om föregångare till CD4+ T-celler infekteras av hiv-1 i thymus, tyder våra data starkt på att ofullständigt undertryckande av viral replikation hos infekterade individer som får HAART fortsätter att sprida infektionen i CD4+ T-cellkompartmentet i det perifera blodet, vilket resulterar i upprätthållandet av CD4+ T-cellreservoaren för hiv-1 .
Acknowledgments
Vi tackar Paul Parks för schemaläggning av patientbesök, Susan Moir för att hon läste detta manuskript och för hjälpsamma diskussioner samt patienterna för deras deltagande i denna studie.
Studieprotokollet godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid University of Toronto och av National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Alla deltagare undertecknade en blankett för informerat samtycke.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
Jr
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
Figurer och tabeller
Samband mellan frekvensen av humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1)-specifika cytotoxiska CD8+ T-lymfocyter och förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler. Frekvensen av CD8+ T-celler som är specifika för hiv-1 bestämdes genom analys av intracellulära interferon (IFN)-γ-positiva celler efter stimulering med hiv-1-specifika peptider som härrör från gag-, pol-, env- och nef-generna. Spearmans rangkorrelationsmetod användes för att få fram P-värden.
Samband mellan frekvensen av cytotoxiska CD8+ T-lymfocyter som är specifika för humant immunbristvirus typ 1 (hiv-1) och förhållandet mellan CD4+:CD8+ T-celler. Frekvensen av CD8+ T-celler som är specifika för hiv-1 bestämdes genom analys av intracellulära interferon (IFN)-γ-positiva celler efter stimulering med hiv-1-specifika peptider som härrör från gag-, pol-, env- och nef-generna. Spearmans rangkorrelationsmetod användes för att få fram P-värden.