Morfologi och fördelning av kalk och folia Tidpunkten för avlagring av kalk i förhållande till utfällning av folia har varit en långvarig fråga när det gäller bildandet av kritavlagringar. För musslor i allmänhet är det välkänt att förlängning uppnås genom tillsats av nytt material i spiralriktningen (dvs. till kommissurmarginalen), och att skalförtjockning sker genom tillsats av karbonat till den inre skalytan, under (dvs. innanför) gammalt skalmaterial17. De kalkhaltiga avlagringar som observerades i 3D-rekonstruktioner hittades inuti och ventralt i förhållande till folia, och de flesta var helt förseglade i skalet av omgivande folia. Detta gällde för den kalk som hittades i umbo, liksom för de kalkhaltiga avlagringar som bildades direkt under tillväxtbrott (fig. 4, 6), även om det fortfarande är oklart om förkalkningen fortsätter i kamrarna efter att de har förseglats, vilket tidigare har antagits23. Även om det inte är vanligt, avslöjade undersökningen av 3D-rekonstruktioner också förekomsten av kalkavlagringar som inte var helt förseglade i skalet. Dessa verkar vara resultatet av en liten mängd krita som fälldes ut på folia vid commissure, som inte var helt förseglad när nästa lager av folia avsattes, vilket lämnade en liten kil av krita exponerad mot skalets utsida (fig. 5C). Att folia ligger utanför kritan tyder på att folia, inte krita, fälls ut som det yttersta skalskiktet som ligger under periostracum, och följaktligen ger strukturellt stöd åt skalet, vilket har noterats i tidigare arbeten29. Dessutom ger avlagringen av folia upphov till yttre egenskaper, t.ex. åsar, tillväxtbrott och andra förändringar i tillväxtriktningen, vilket skapar fördjupningar på den inre skalytan som senare fylls med krita. Mönstret för kritbildningen under tillväxtbrott och andra yttre egenskaper bekräftar tidigare observationer att krita fyller ut fördjupningar på skalens inre ytor18,20,24,26,27,30,31, men ger också ett sammanhang för hur dessa fördjupningar bildas.
För ostron representerar tillväxtbrott en betydande förändring av tillväxtrörelsen och är viktiga i samband med kritbildningen, eftersom dessa egenskaper ofta är förknippade med kalkhaltiga avlagringar. Därför kan en mer fullständig förståelse av hur tillväxtbrott bildas bidra till att belysa funktionen och tidpunkten för kritans tillväxt. Baserat på observationerna om förhållandet mellan kalk och folia finns det tre möjliga modeller för skalbildning vid tillväxtbrott, som alla har olika implikationer för kalkens funktion i ostronskal, och även för mantelns beteende under skalbildningen mer generellt (fig. 8).
Modell 1 För det första lägger manteln ner periostracum (skalets yttersta organiska skikt), vilket följs av att ett tunt lager folia deponeras direkt under, mot skalets inre. Därefter skiljer sig manteln från det tidigare bildade skalet, och utan att dra sig tillbaka nämnvärt, börjar den bilda ett lager av periostracum och folia i en sned vinkel mot det tidigare tillväxtplanet, vilket skapar en tillväxtpaus. Denna nya geometri skapar en fördjupning på den inre skalytan, direkt under den plats där det andra lagret av periostracum och folia förgrenade sig från det första. Denna fördjupning fylls sedan med krita. När ostronet fortsätter att tjockna och utvidga sitt skal utåt, försluts denna kalkhaltiga avlagring under tillväxtbrottet inom skalet med ett nytt lager folia. I modell 1 orsakas tillväxtbrottet av att manteln lossnar från det ursprungliga lagret av periostracum, vilket kan orsakas av att periostracum bryts vid kommissuren, eller av något annat avbrott (fig. 8: rad 1).
Modell 2 Först lägger manteln ner periostracum, vilket följs av att ett tunt lager av folia deponeras direkt under det yttre organiska lagret. Därefter lossnar manteln från det lager av periostracum som håller på att bildas och drar sig tillbaka till en punkt längs det tidigare bildade skalet. Därefter börjar manteln bilda ett nytt lager av periostracum och folia, inåt från det tidigare lagret, i en vinkel snett mot det tidigare växande planet. Denna nya geometri skapar en fördjupning på den inre skalytan, direkt innanför den plats där det andra lagret av periostracum och folia förgrenade sig från det första. Denna fördjupning fylls sedan med krita. När ostronet fortsätter att tjockna och utvidga sitt skal utåt, försluts denna kalkhaltiga avlagring under tillväxtbrottet inom skalet av ett nytt lager folia. I modell 2 orsakas tillväxtbrottet också av att manteln lossnar från det första lagret av periostracum, vilket kan orsakas av att periostracum bryts vid kommissuren eller av något annat miljöavbrott. Detta scenario skiljer sig från modell 1 i fråga om mantelns beteende. I modell 2 drar sig manteln tillbaka och bygger nytt skalmaterial inåt från det tidigare tillväxtplanet. I modell 1 däremot drar manteln sig inte tillbaka, utan rör sig snarare mot det inre utrymmet mellan klaffarna och fäller ut nästa lager samtidigt som den förblir utsträckt (fig. 8: rad 2).
Modell 3 Först lägger manteln ner periostracum, vilket följs av avlagring av ett tunt lager folia direkt under det yttre organiska lagret. Därefter fäller manteln ut en liten hög av kalk som sträcker sig till den yttersta utbredningen av det tidigare odlade skalet. Manteln lossnar från det lager av periostracum som håller på att bildas och drar sig tillbaka till en punkt längs det tidigare bildade skalet. Därefter fälls ett nytt lager av periostracum och folia ut inuti den ursprungliga krithögen och sträcker sig förbi denna kritavlagring, vilket gör att kritan exponeras på skalets utsida. Detta nya tillväxtbrott skapar också en fördjupning på den inre skalytan, direkt under den punkt där den första folia, den umboformade änden av kalkhögen och det andra lagret av folia och periostracum korsar varandra. Detta utrymme fylls sedan med kalk, och när ostronet fortsätter att tjockna och utvidga sitt skal utåt, försluts den kalkhaltiga avlagringen under tillväxtbrottet i skalet. I detta fall beror inte bildandet av tillväxtbrottet på att manteln separeras från det första lagret av periostracum. Istället är förändringen av tillväxtens riktning ett resultat av bildandet av kalkhögen, som riktar ny tillväxt i en vinkel snett mot det tidigare tillväxtplanet. För skal som observerats i den här studien är tillväxtbrott inte förknippade med kalkhaltiga avlagringar (dvs. den första kalkhögen som beskrivs här) som är exponerade mot skalets utsida, som i modell 3. Därför kan vi utesluta modell 3 som förklaring till tillväxtbrott och förändringen i skalets tillväxtriktning omedelbart efter ett tillväxtbrott (fig. 8: rad 3).
Modellerna 1 och 2 är svårare att särskilja enbart på grundval av skalmorfologin, eftersom de, som beskrivits, resulterar i samma eller mycket likartade uppsättning kännetecken, och de största skillnaderna mellan de två modellerna gäller mantelns beteende under bildandet av tillväxtbrott. Andra bevis kan dock användas för att skilja ut vilken modell som är mest sannolik för att ge upphov till de observerade skalegenskaperna. I modell 1 drar sig inte manteln tillbaka utan rör sig i stället bort från det tidigare tillväxtplanet genom att svänga bort från det gamla skalet. Därför bör det nya lagret av periostracum och folia vara lika långt som de ursprungliga lagren, eftersom manteln har förblivit helt utsträckt. Om manteln däremot drar sig tillbaka (modell 2) och bygger det andra lagret av periostracum utåt från det gamla skalmaterialet, kommer de nyare lagren att vara kortare (dvs. sluta närmare umbo än det första lagret av folia) tills tillräcklig tillväxt har skett för att förlänga de nya folierna bortom det gamla skalmaterialet. Detta andra mönster har observerats i tvärsnittet i figur 1D. Därför är modell 2, som innefattar att manteln dras tillbaka, den mest sannolika representationen av hur tillväxtbrott bildas och hur manteln beter sig i detta sammanhang. Dessutom stämmer modell 2 väl överens med tidigare arbeten där man direkt observerade att ostronens mantlar drog ihop sig under skalbildning och cementering32. I ett experiment där skalkanten på den vänstra klaffen hos ett ostron avlägsnades började manteln därefter att bilda ett nytt lager av periostracum på gammalt skalmaterial, dorsalt om commissure (32, fig. 7B). Detta visar att manteln drar sig tillbaka för att bilda nytt periostracum och skal utåt från gammalt skalmaterial i enlighet med modell 2. Ytterligare observationsarbete, som det som Yamaguchi32 utfört, tillsammans med noggranna mätningar för att fastställa hur långt bakåt manteln drar sig tillbaka under bildandet av tillväxtbrott, skulle ge definitiva bevis för att stödja modell 1 eller modell 2.
Kalkiga avlagringar och cementering Kalkiga avlagringar observerades vara omfattande på platser där skalet återfästes till ett substrat, t.ex. där ostron cementerade sig till andra individer eller till nätmaterial i en bur (fig. 2L, 7). För ostron som återfästes på burmaterial var periostracum det yttersta lagret, vilket tyder på att det lades ner först för att anpassa sig till den oregelbundna ytan. Liknande observationer gjordes också av Yamaguchi32 , som också föreslog att manteln är en aktiv deltagare i skalcementet genom att trycka in nybildat periostracum i substratet och på så sätt främja fastsättningen. Därför är kalkavlagringar involverade i cementering åtminstone i den utsträckning som kalk gör det möjligt för ostronet att anpassa sig till ett ojämnt substrat samtidigt som ett gynnsamt inre utrymme bibehålls.
Interessant nog noterade Harper33 närvaron av en kalkavlagring utanför ett M. gigas-skal, mellan periostracum och substratet. Om förekomsten av kalk mellan skalet och substratet är en vanlig företeelse skulle detta tyda på att kalk spelar en mer central roll i cementeringen än att helt enkelt ge förmågan att anpassa sig till ett ojämnt substrat. I den aktuella studien snittades och undersöktes tre par ostron som hade återfästs till varandra för att se om det fanns dessa kalkhaltiga avlagringar utanför periostrakan (fig. 3). Inga sådana hittades dock. Även om detta kan tyda på att det krävs ett större urval för att undersöka detta fenomen, föreslår vi att externa kalkavlagringar, som de som hittades av Harper33, var avvikande. Detta tyder på att krita i allmänhet inte används direkt för fastsättning av ostron. Men hur placerades den krita som Harper33 observerade mellan periostracum och substratet?
Men även om mantelns pressning av periostracum mot substratet kan vara en komponent i cementeringsprocessen för M. gigas32, spelar ett mantelproducerat organiskt-inorganiskt lim en central roll för att fästa ostron vid substratet. Harper33 antog att den organiska fraktionen av cementet kan röra sig genom det permeabla periostracum för att fylla utrymmet mellan detta lager och substratet och på så sätt fästa ostronet. Det finns ytterligare bevis som tyder på att organiska ämnen som utsöndras från manteln spelar en central roll när det gäller att bestämma kristallmorfologin i blötdjursskal34,35,36,37,38,39. Om de organiska prekursorer till kalkhaltig kalcit som utsöndras från manteln oavsiktligt har läckt ut genom det porösa periostracumet kan detta förklara förekomsten av kalk i ett utrymme som normalt skulle ha upptagits av cement33. Även om detta förblir en spekulativ hypotes skulle ytterligare arbete som karakteriserar de organiska beståndsdelarna i skalskikten och tar upp dessa organiska ämnens förmåga att mobiliseras genom periostracum hjälpa till att lösa dessa frågor.
Kalkens funktionella ekologi De data som presenteras här tyder på att kalk är förknippad med morfologisk variabilitet hos M. gigas och är användbar för cementering eftersom den gör det möjligt för djuret att anpassa sig till ett oregelbundet substrat samtidigt som det bibehåller ett gynnsamt inre utrymme. Även om många andra musslor kan uppnå en cementerande livsstil utan användning av krita, ger kritans höga porositet en skalstruktur som är mycket mindre tät än omgivande folier19,40. Dessutom är kalkbildning förknippad med snabb tillväxt och mycket stora, tjocka skal10,23. Detta tyder på att krita, förutom att vara användbar för cementering och för att tillgodose morfologisk plasticitet, möjliggör snabb skaltillväxt genom att fungera som ett relativt billigt byggmaterial under skalkonstruktionen. Framtida arbete där man jämför styrkan eller hållbarheten hos cementering i ostron som producerar krita jämfört med ostron och andra cementerande musslor som inte gör det (t.ex. Chamids) skulle ge ytterligare insikt i de avvägningar som är förknippade med användningen av detta material för att underlätta cementeringen. Slutligen, även om nya arbeten tyder på att folia och krita fälls ut synkront20,41 , kvarstår öppna frågor om tidpunkten för folia respektive kritans avlagring i skalet. Ytterligare experiment med användning av både markeringstekniker (t.ex. calcein) och geokemi med stabila isotoper skulle bidra till att fastställa det tidsmässiga förhållandet mellan krita och folia, särskilt när det gäller bildandet av tillväxtbrott och andra egenskaper som diskuterats här.