1 juni 2016 (Vol. 36, No. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Grundare och huvudskribent DeeAnn Visk Consulting
Genterapi måste bryta igenom cellulära vallgravar utan att återskapa Jerichos fall i miniatyr
Immunoterapier mot cancer, vacciner mot nya virus (eller gamla virus på nya ställen) och försök att lösa patogena defekter i enstaka celler – alla försöker man införliva transfektionsteknik. Denna teknik, som omfattar olika sätt att föra in nukleinsyror i celler, är mycket lovande, men innebär också allvarliga utmaningar.
Dessa utmaningar har varit mest framträdande i försöken att införa genterapi, som har haft svårt att lösa problemet med svårtransfekterade celler, organ och hela djur.
Sådana transfektionsutmaningar har tagits upp av flera bioteknikföretag. MaxCyte, Lonza och Mirus Bio erbjuder till exempel elektroporation som en metod som lämnar lite rester efter sig. Elektroporation är dock inte lämplig för alla djur, så det behövs andra metoder. En alternativ teknik är virusinfektion. Den används av företag som GenVec.
En annan utmaning, som är särskilt relevant för viral transfektion, är möjligheten att stimulera ett immunsvar. Denna potentiella negativitet kan dock bli verkligt positiv i rätt sammanhang, vilket råkar vara vaccinutveckling. Thermo Fisher Scientific har specialiserat sig på att utnyttja metoder för viral transfektion för att stärka vaccinationsmekanismer. Företaget erbjuder också traditionell kemiskt baserad transfektion som fungerar på hela djuret.
Tillsammans erbjuder de företag som hittills nämnts teknik som täcker alla de viktigaste formerna av terapeutiskt relevant transfektion: kemiskt baserad transfektion, icke-kemiska metoder (främst elektroporation) och viral transduktion. Hybridmetoder håller också på att utvecklas, vilket kommer att framgå av följande avsnitt.
Elektroporation
MaxCytes elektroporationsplattform är GMP-kompatibel och sömlöst skalbar från forskning till kommersiell skala. ”Vårt flödeselektroporationssystem gör det möjligt att transfektera en miljon till flera hundra miljarder celler på mindre än 30 minuter i ett helautomatiskt slutet system”, förklarar Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. ”Vårt system är både ISO 9000- och FDA-kompatibelt, så det kan lätt tillgodose behoven för tillverkning på terapeutisk nivå.”
”Vi samarbetar rutinmässigt med läkemedels- och bioteknikföretag för att utveckla ex vivo-konstruerade immun- och stamcellsterapier. Ibland är målet att snabbt tillverka vacciner och biologiska läkemedel med hög avkastning, t.ex. antikroppar. Andra gånger gör vi det möjligt för kunderna att skapa storskalig högtiterproduktion av virala vektorer med hjälp av suspenderade och adherenta celler. Detta underlättar inte bara den terapeutiska utvecklingen utan kan också påskynda tillämpningar för läkemedelsforskning.”
Denna förmåga att bearbeta celler i stora eller små mängder gör det möjligt för forskare vid bänken att utveckla ett processprotokoll med hjälp av flödeselektroporation för små cellmängder. Att skala upp denna process är sedan smidigt utan den vanliga huvudvärken att upprätthålla kvaliteten, eftersom transfektionsprocessen förblir densamma.
”Denna riskminskning är mycket attraktiv för våra partner. Att säkerställa konsistens från forskning, till klinik, till kommersiell skala, och från körning till körning, från donator till donator och från patient till patient är avgörande för att effektivt föra terapier genom utvecklingsprocessen”, hävdar Dr. Peshwa.
Men även om kemiska metoder och lipidmetoder fungerar bra i forskning med etablerade cellinjer finns det ofta oväntade konsekvenser av att transfektera primära celler. Dessutom är dessa traditionella kemiska metoder för att transfektera celler svåra att skala upp till industriell produktion.
Elektroporation, den icke virala metod som MaxCyte använder, gör att de transfekterade cellernas biologi förblir i ett mer naturligt tillstånd i vilken skala som helst. Genom att förhindra oavsiktliga konsekvenser under transfektionsprocessen kan MaxCytes teknik undvika att skapa vägspärrar samtidigt som den löser behovet av hög transfektionseffektivitet.
”Dessa terapeutiska ingrepp måste vara praktiskt taget garanterade att ha minimal oavsiktlig negativ inverkan på de celler som modifieras – hela biologin måste vara densamma under varje steg i processen”, insisterar Dr Peshwa. ”Dessutom kan vårt flödeselektroporationssystem användas på ett automatiserat sätt. Det används redan rutinmässigt i Japan för kommersiella terapeutiska behandlingar och befinner sig i olika stadier av införande över hela världen.”
Ett annat övervägande är var transfektionen äger rum. Transporteras celler som skördats från en patient till en annan stad för behandling? Vad händer om ett paket går förlorat, försenas eller utsätts för temperatursvängningar? Den plattform som MaxCyte erbjuder ger möjlighet att utveckla nya terapier genom att bearbeta patienternas celler på plats och kringgå de stora logistik- och COGS-problemen (kostnad för sålda varor) med andra metoder.
Engineering av celler är avgörande för utvecklingen av cellbaserade terapier. MaxCytes elektroporationssystem kan undvika oavsiktlig modifiering av cellens fenotyp samtidigt som det uppfyller de viktigaste behoven av utmaningar inom celltekniken: effektivitet, konsistens, portabilitet och skalbarhet, enligt företaget.
Virala transduktioner
Virala vektorer är särskilt användbara för tranfektion av hela djur eller för användning av vävnader som kan vara svåra att nå via kemiska eller elektroporationsmetoder. GenVec har specialiserat sig på användningen av virala vektorer, särskilt adenovirus, för att leverera gener i terapeutiskt syfte.
”Vid en första anblick verkar de problem som är förknippade med immunsvaret på virala vektorer vara problematiska”, förklarar doktor Doug Brough. ”Vi har dock funnit att detta kan användas för att stimulera ett immunsvar mot främmande material, så att adenovirus skulle kunna användas för att leverera vacciner.”
I själva verket har GenVec grundligt studerat adenoviruset och genererat flera olika ”smaker” av adenovirus. När man utforskar adenovirus i andra arter, t.ex. gorilla- och aparter, kan forskarna använda vektorer som är utformade för att undvika den redan existerande immunitet som den allmänna mänskliga befolkningen har mot adenovirus.
”Det stora biblioteket av vektorer som GenVec erbjuder kallas Adenoverse™”, informerar Dr. Brough. ”Vi har raderat stora delar av adenoviruset för att begränsa den medfödda toxiciteten i samband med behandling med adenovirus. Förutom att förhindra ett skadligt immunsvar mot vektorn gör detta att vi kan få plats med upp till 12 kb i viruset.”
Med hjälp av olika tillvägagångssätt har GenVec samarbetat med ett antal företag om olika tillämpningar, nukleinsyraterapier och teknik för genredigering. Modifierade adenovirus kan leverera zinkfingermetoder, både in vitro och in vivo.
Ett exempel på ett sådant samarbete finns med Novartis kliniska prövning för att regenerera sensoriska celler i innerörat. ”Genom att infektera celler i innerörat med en gen som kodar för ett viktigt reglerande protein kan nya mekanosensoriska celler genereras för att ersätta de celler som förlorats på grund av skada eller inneboende genetiska förhållanden”, förklarar Dr. Brough.
Andra gemensamma projekt kan hittas med partnerskap inom enheter för att behandla cancer och utveckla vacciner. ”När det är dags att kommersialisera en teknik använder GenVec en cellinje som tidigare godkänts av FDA för dessa tillämpningar”, förtydligar Dr Brough.
”En annan uppenbar fördel med att använda adenovirus är att de lätt kan transfektera hela djur. En förödande sjukdom hos lantbruksdjur, som kallas mul- och klövsjuka, fortplantas till exempel av en mängd olika virotyper. Vårt system skulle göra det möjligt att snabbt byta ut den stam som orsakar ett utbrott och att snabbt leverera ett skräddarsytt vaccin”, säger dr Brough.
Nucleofection
Lonza erbjuder en avancerad form av elektroporation som kallas Nucleofection™, som använder celltypspecifika transfektionslösningar i kombination med ett mer nyanserat pulsleveranssystem som möjliggör transfektion av många olika celltyper, särskilt normala primära mänskliga celler.
”Istället för att använda standardbuffertlösningar för elektroporation använder vi celltypspecifika transfektionslösningar”, säger Gregory Alberts, doktorand, en global sakkunnig på Lonza. ”Detta gör det möjligt för oss att stabilisera de porer som genereras under pulsleveransen. Vi spekulerar i att de porer som bildas i cellmembranet under standardelektroporation sluter sig snabbt. Vår teknik stabiliserar de porer som bildas genom elektroporation och gör det möjligt för materialet att diffundera in i cellen och mer specifikt in i cellens kärna.”
Nucleofection-metoden utnyttjar många olika substrat: DNA, mRNA, siRNA, peptider, proteiner och små molekyler. Transfektionseffektiviteten för siRNA och mRNA är mycket god, bättre än 90 %. Små peptider transfekterar vanligtvis med cirka 80 % effektivitet, och effektiviteten för plasmid-DNA ligger mellan 50 % och 90 %, beroende på celltyp. Även stora substrat, större proteiner som antikroppar eller bakteriella artificiella kromosomer (BAC), kan komma in i målcellerna med en rimligt effektiv transfektionseffektivitet.
”Nukleoinfektion är förvånansvärt flexibelt”, förklarar dr Alberts. ”Den har använts för att transfektera alla typer av primära mänskliga celler. Den har använts vid generering av iPSC (inducerade pluripotenta stamceller), vid transfektion av CRISPR och andra substrat för genomredigering samt vid transfektion av mer exotiska mål som Plasmodium-familjen av parasiter som orsakar malaria. Andra liknande organismer kan också transfekteras med Nucleofection för att möjliggöra forskning om tropiska sjukdomar.”
Nucleofection-plattformen är skalbar. Till exempel kan Nucleofection-systemet med hög genomströmning hantera 96- och 384-våningsformat. Ofta kommer detta system att användas i en kärnscreeninganläggning. Forskare vid bänken kan använda 4D Nucleofector med lägre genomströmning för att optimera testförhållandena. Eftersom 4D Nucleofector på bänken använder samma transfektionsförhållanden, arbetar med samma antal celler och ger samma prestanda som enheterna med högre genomströmning, behöver analysen inte optimeras på nytt när det är dags att gå över till en större skala.
”Systemets kontinuitet gör det möjligt att jämföra äpplen med äpplen när man skalar upp eller ner projektet”, illustrerar Dr. Alberts.
”Vi håller på att beta-testa en ny transfektionsanordning för stora volymer som kommer att kunna transfektera 200 miljoner till 1 miljard celler i ett format som sträcker sig från 1 till 20 mL. Preliminära resultat visar att enheten transfekterar primära mänskliga celler eller cellinjer på samma nivåer som de andra Lonza Nucleofector-enheterna”, fortsätter Dr. Alberts. ”Denna produkt kommer endast att släppas för forskningsändamål, även om det på grund av Nucleofections förmåga att transfektera primära mänskliga celler så bra utan tvekan kommer att finnas intresse för att använda denna anordning i mer kliniskt inriktade tillämpningar.”
Dr. Alberts föreställer sig att Nucleofection skulle kunna spela en roll i innovativa och individanpassade cancerterapier, t.ex. terapi med chimära antigena T-celler (CAR-T), liksom andra cellbaserade terapier som kräver transfektion eller genomisk modifiering av primära mänskliga celler.
”Nucleofections förmåga att enkelt och effektivt transfektera primära mänskliga T-celler kommer att väcka uppmärksamhet i genterapeutiska metoder för att behandla sjukdomar. Lozas tillvägagångssätt för potentiella gen-
terapitillämpningar har också ett mycket litet fotavtryck. Detta är avgörande eftersom ”överblivna” maskiner från andra transfektionstekniker kan leda till oavsiktliga biologiska konsekvenser”, avslutar dr Alberts.
Vetenskapsmän vid Lonza har utvärderat företagets Nucleofection-teknologis förmåga att transfektera dissocierade aortiska glatta muskelceller (AoSMC) från vuxna råttor. Kryokonserverade AoSMC från råttor tinades upp och odlades i sju dagar i 24-hålskulturplattor, och cellerna transfekterades i adherens med hjälp av AD1 4D-Nucleofector Y-lösning. Tjugofyra timmar efter transfektion fixerades cellerna och analyserades. Actin visas i rött, GFP i grönt.
Formuleringar
Mirus Bio utvecklar och tillverkar nya transfektionsformuleringar som gör det möjligt att leverera många olika typer av nukleinsyramolekyler med hög effektivitet och låg toxicitet. Många av formuleringarna är fria från komponenter från djur. ”Djurfritt” är en viktig egenskap för prekliniska och kliniska tillämpningar.
CRISPR-systemet kräver leverans av ett guide-RNA (gRNA) och uttryck av Cas9-endonukleaset, som kan vara i form av protein, mRNA eller DNA. Mirus Bio erbjuder transfektionslösningar för att stödja effektiv leverans av alla de olika Cas9-kodande molekylerna. Vid användning av kemiska transfektionsmetoder för leverans av Cas9-protein kan forskare använda mycket lägre nivåer av protein om det är prekomplexerat med gRNA.
”Vissa celltyper som är svåra att transfektera ger högre klyvningseffektivitet med transfektion av Cas9-proteinet som är komplext i RNP-komplexet (ribonukleoproteinkomplexet)”, säger Laura Juckem, Ph.D., gruppledare för R&D på Mirus Bio. ”Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System levererar effektivt RNP-komplex och gör det möjligt att använda lägre koncentrationer av Cas9-protein jämfört med elektroporation.”
En annan utmaning som företagen står inför är övergången från adherenta kulturer till suspensionskulturer för att rymma den stora mängd material som behövs för kliniska prövningar. Detta gäller särskilt för produktion av rekombinanta lentivirus och adeno-associerat virus (AAV). ”Vi har ett nära samarbete med våra kunder för att se till att deras transfektioner är framgångsrika och att förändringar i deras arbetsflöde fortfarande ger högkvalitativa produkter”, förklarar Dr Juckem.
”För cellbaserad terapi utvecklades CHO-gro® Expression System för att ge hög avkastning av bioterapeutiska proteiner i suspenderade CHO-celler. Detta optimerade system främjar celltillväxt med hög densitet och gör det möjligt för forskare att få tillräckligt med protein för att utföra prekliniska studier och inledande karaktäriseringsanalyser”, avslutar Dr. Juckem.
Denna bild, från en Mirus Bio-presentation som beskriver den högeffektiva transfektionen av stamceller, visar att somatiska celler, t.ex. vuxna fibroblastceller, kan transfekteras eller transduceras via flera metoder med en kombination av transkriptionsfaktorer. När cellerna väl har omprogrammerats till ett pluripotent tillstånd kan de styras till olika öden genom tillsats av tillväxtfaktorer och/eller transfektion av selektionsmarkörer som styrs av celltypsspecifika promotorer. Bilden understryker att transfektionsreagenser kan läggas till i ett arbetsflöde för stamceller vid flera tillfällen.
Hela djurmetoden
Thermo Fisher Scientific håller sig à jour med kundernas behov av att generera mer biologiskt relevanta data med hjälp av primära celler i stället för omortaliserade cellinjer. Primärceller är traditionellt sett svårare att transfektera med kemiska metoder. Data som genereras från primära cellkulturer tenderar dock att ge svar som bättre kan översättas till in vivo-modeller för hela djur.
Tredimensionella cellkulturmodeller, som ger mer relevanta resultat än tvådimensionella cellkulturer, är svårare att transfektera med traditionella metoder.
”Det är en utmaning att transfektera primära kulturer med DNA. Att använda siRNA (small inhibitory ribonucleic acid), mRNA (messenger RNA) och protein direkt accepteras lättare av primära celler, eftersom dessa föreningar bara behöver levereras till cytoplasman och inte till cellkärnan”, konstaterar Xavier de Mollerat du Jeu, doktorand, direktör för forskning och utveckling vid Thermo Fisher Scientific.
”Leverans till cellkärnan sker när cellerna delar sig”, fortsätter Xavier de Mollerat ”Eftersom primära celler inte delar sig lika lätt som cellinjer kan vi kringgå problemet genom att leverera molekyler till cytoplasman i stället för till cellkärnan.”
I vår strävan efter mer biologiskt relevanta system i hela djur har vi funnit att användning in vivo av Invivofectamine® 3.0 effektivt kan minska uttrycket av ett protein med 90 % i leverceller”, förklarar dr de Mollerat. ”Denna in vivo-användning av Invivofectamine ger forskarna en effektivare modell för hur behandlingar ser ut i hela djuret.”
En annan tillämpning av transfektionsteknik är utveckling av vacciner. Tidslinjen för utveckling av vacciner kan förkortas enormt genom att använda transfekterade mRNA för att uttrycka antigener mot vilka kroppen kan utveckla ett immunsvar. Med tanke på det antal nya virus som finns i världen, t.ex. zika och chikungunya, kommer förmågan att snabbt utveckla vacciner att avsevärt förbättra världshälsan.
Med den fortsatta utvecklingen av immunterapier riktade mot cancer är T-cellerna ofta riktade mot specifika receptorer. ”Vi har arbetat med företag som är intresserade av att utveckla dessa terapier”, förklarar dr de Mollerat. ”Vi har ett nära samarbete med företagen för att ta itu med frågorna om hur man ska tillverka dessa behandlingar, göra dessa behandlingar i stor skala och göra dem tillgängliga över hela världen.”
Invivofectamine 3.0 är ett reagens som tillhandahålls av Thermo Fisher Scientific för in vivo-leverans av RNAi. Enligt företaget leder en enda injektion till signifikant knockdown på dag 1 och i upp till tre veckor. Detta resultat framkom i en studie där reagensen injicerades i olika doser (1, 0,5 och 0,25 mg/kg) i svansen på en gnagare. Serum samlades in på dagarna 2, 5, 9, 16, 23 och 30, och serumet analyserades för FVII-proteinnedbrytning genom en kromogen analys. Företaget noterade att högre mängder siRNA i de injicerade komplexen resulterade i en mer långvarig knockdown inom det testade intervallet.